體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)sFlt-1抑制小鼠骨肉瘤生長和相關(guān)癌基因表達的研究.pdf

1、第一部分 體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的sFlt-1抑制小鼠骨肉瘤生長的實驗研究研究背景骨肉瘤是一種常見的高度惡性骨腫瘤。近年來應(yīng)用的多種治療方法，包括廣泛的手術(shù)切除、截除患肢和輔助性的化療已經(jīng)改善了患者的預(yù)后；但是仍有接近半數(shù)的患者療效不理想。骨肉瘤病人的治療仍舊是一項艱巨的任務(wù)。 近來針對惡性腫瘤的一種新的治療策略是阻斷其血管發(fā)生。事實上，腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成；這一過程是通過血管發(fā)生的機制來調(diào)節(jié)，血管生成的

2、促進因素以及抑制因素決定了腫瘤血管的發(fā)展方向。目前已經(jīng)有很多促血管生長因子被證實，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的特異性和作用最強。 研究證實，包括骨肉瘤在內(nèi)的很多惡性腫瘤的生長發(fā)育和預(yù)后不良同VEGF的高表達相關(guān)聯(lián)；這些結(jié)果提示，抑制VEGF的生物學(xué)效應(yīng)也許是骨肉瘤治療中很有希望的一種方法。 VEGF通過結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的表面受體來發(fā)揮其生物效應(yīng)，這些表面受體主要包括VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-

3、1)等，它們是左右細(xì)胞增殖、分化、遷移和新陳代謝等信號傳導(dǎo)通路的必需因素?？扇苄訤it-1(sFlt-1)是Fit-1的可替代形式，同VEGF有著與Fit-1相當(dāng)?shù)挠H和力和特異性，但是缺乏細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，所以無法傳遞信號。已經(jīng)有一些研究應(yīng)用sFlt-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)阻斷VEGF生物學(xué)效應(yīng)以達到抑制不同實體瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的，總體結(jié)果分析表明，這個方法是一種非常有潛力的血管生成抑制策略。而應(yīng)用sFlt-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)阻斷VEGF生物學(xué)

4、效應(yīng)的方法治療骨肉瘤尚未見有報道。 目的 調(diào)查逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的sFlt-1基因針對高VEGF表達的人骨肉瘤G-292細(xì)胞進行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，并構(gòu)建重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨肉瘤模型評估sFlt-1轉(zhuǎn)基因治療對于骨肉瘤生長的抑制作用。 材料與方法 1．動物 30只雌性四周齡的SCID小鼠作為骨肉瘤模型的宿主。這些SCID小鼠的生長環(huán)境是無菌的，被提供經(jīng)過高壓消毒的食物和飲水；實驗開始之前隔離至少一

5、周時間。 2．骨肉瘤細(xì)胞株高VEGF表達的人骨肉瘤G-292細(xì)胞株進行細(xì)胞培養(yǎng)，長至90％融合狀態(tài)時測定細(xì)胞活力以及細(xì)胞數(shù)目，按照1：6-1：8比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。 3．基因轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼sFlt-1和逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼LacZ針對G-292細(xì)胞進行體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。500μl的106cfu retrosFlt-1(或MFG-LacZ)、500μl新鮮培養(yǎng)液和終濃度為8μg／ml的聚凝胺一同加入G-292細(xì)胞；37℃孵育8個小

6、時后第二次加入同樣劑量的上述轉(zhuǎn)導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中sFlt-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物的含量通過ELISA實驗測定；X-gal染色測定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LacZ基因的表達及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 4．骨肉瘤模型建立 SCID小鼠被隨機分為3組，每組10只，分別應(yīng)用G-292細(xì)胞、sFlt-1轉(zhuǎn)導(dǎo)G-292細(xì)胞、LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)G-292細(xì)胞接種到小鼠一側(cè)肢體的脛骨近端建立骨肉瘤模型。另外一側(cè)肢體單純注射不包含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為假手術(shù)組。腫瘤細(xì)胞接種8周后收集脛

7、骨骨肉瘤以及骨組織標(biāo)本。 5．MieroCT測評應(yīng)用MicroCT動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長。接種細(xì)胞后當(dāng)天以及第2，4，6，8周各掃描一次。采集MicroCT圖像后對腫瘤的長和寬進行測量并應(yīng)用公式計算腫瘤體積。 6．分子生物學(xué)檢測骨肉瘤和骨組織標(biāo)本抽提總RNA，應(yīng)用RNeasy Mini Kit試劑盒作進一步的純化處理。實時定量PCR方法測定VEGF和sFlt-1基因的相對定量表達。 7．組織學(xué)和免疫組織學(xué)檢查實驗動物

8、接受細(xì)胞接種8周后收集脛骨近端的骨肉瘤組織和假手術(shù)組的骨組織。應(yīng)用10％福爾馬林緩沖液固定，12％EDTA脫鈣，石蠟包埋。蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的抗生物素-生物素-過氧化物酶法(ABC法)檢測VEGF，sFlt-1和CD34的表達。 數(shù)字影像收集后應(yīng)用Image-Pro軟件包對比分析不同組間VEGF和sFlt-1積分光密度(IOD)的差異。CD34染色結(jié)果用來測定骨肉瘤微血管密度(MVD)

9、。 8．統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗或方差分析并進行多重比較。p<0．05表示具有顯著性差異。所有數(shù)值用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)論 1，體外使用逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼sFlt-1成功轉(zhuǎn)導(dǎo)了高VEGF表達的人骨肉瘤G-292細(xì)胞，建立了能夠穩(wěn)定表達sFllt-1基因的骨肉瘤細(xì)胞株。 2，MicroCT動態(tài)監(jiān)測、實時定量PCR測定和免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果證實VEGF高表達與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

10、 3，MicroCT掃描動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞種植后4，6，8周時，sFlt-1轉(zhuǎn)導(dǎo)組骨肉瘤的體積明顯小于G-292組和LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)組，表明sFlt-1轉(zhuǎn)導(dǎo)組骨肉瘤生長被持續(xù)抑制，證明sFlt-1在骨肉瘤生長發(fā)育過程中是一種長久有效的干預(yù)因素。 4，免疫組織化學(xué)CD34染色結(jié)果顯示，sFlt-1轉(zhuǎn)導(dǎo)組骨肉瘤微血管密度明顯小于其他兩組；證實sFlt-1通過阻滯VEGF的生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致了骨肉瘤生長發(fā)育的抑制。 第二

11、部分:c-myc和c-fos原癌基因在小鼠骨肉瘤模型中的表達及意義研究背景伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，與惡性腫瘤發(fā)育和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)癌基因通過DNA重排(前病毒插入、染色體易位和DNA擴增)而被激活。這些基因序列的修改可能導(dǎo)致基因的表達增強或失去控制。在骨肉瘤中，已經(jīng)有很多種致癌基因和抑癌基因被發(fā)現(xiàn)和證實，其中以c-myc和c-fos最為活躍。c-myc原癌基因是第8對染色體編碼的轉(zhuǎn)錄因子，它涉及到細(xì)

12、胞生長的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制和特異靶基因轉(zhuǎn)錄子的調(diào)控。c-fos原癌基因是v-fos的細(xì)胞同系物，它調(diào)控著成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。 目的 調(diào)查c-myc和c-fos兩種原癌基因在重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠骨肉瘤模型中的表達，進一步探討VEGF，sFlt-1以及骨肉瘤的生長和抑制同它們的關(guān)聯(lián)。 材料和方法 1．實時定量PCR測定 c-myc和c-fos基因的實時定量表達應(yīng)用熒光定量PCR分析儀測定，并計

13、算實驗組相對于假手術(shù)組的基因相對定量表達。 2．免疫組織化學(xué)檢測實驗動物接受細(xì)胞接種8周后收集脛骨近端的骨肉瘤組織和假手術(shù)組的骨組織。應(yīng)用10％福爾馬林緩沖液固定，12％EDTA脫鈣，石蠟包埋。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的抗生物素-生物素-過氧化物酶法(ABC法)檢測c-myc和c-fos基因的表達。數(shù)字影像收集后應(yīng)用Image-Pro軟件包對比分析不同組間積分光密度(IOD)的差異。 3．統(tǒng)計學(xué)分析SPSS軟件包對各組實驗數(shù)據(jù)進

14、行t檢驗或方差分析并進行多重比較。p<0．05表示具有顯著性差異。所有數(shù)值用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)論： 1，在G-292組和LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)組骨肉瘤樣本中，實時定量PCR和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果都證實了c-myc和c-fos原癌基因同VEGF一樣具有高表達。表明這兩種癌基因同骨肉瘤的生長發(fā)育密切相關(guān)。 2，在sFlt-1轉(zhuǎn)導(dǎo)組骨肉瘤樣本中，c-myc原癌基因的表達低于G-292組和LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)組，有顯著性差異。提示骨