內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)治療小鼠黑色素瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新生血管形成對(duì)一定大小腫瘤的生長具有重要意義。抗腫瘤血管生成治療的作用對(duì)象是遺傳相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞，不易產(chǎn)生耐藥，因此抑制血管生成成為腫瘤治療研究的重要熱點(diǎn)之一。在目前發(fā)現(xiàn)的40多種抗腫瘤血管生成抑制劑中，內(nèi)皮抑素的作用最強(qiáng)。盡管已證實(shí)它的重組蛋白形式治療可完全抑制動(dòng)物腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但由于需要長期應(yīng)用，體外性質(zhì)不穩(wěn)定，大量生產(chǎn)困難等因素限制了其重組蛋白形式的廣泛應(yīng)用?；蛑委熖峁┝艘环N替代途徑可解決上述問題，而腺病毒是目前應(yīng)用最廣泛

2、的載體之一。 該實(shí)驗(yàn)獲得了內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，觀測了它對(duì)黑色素瘤的作用效果，以期為高度惡性、易轉(zhuǎn)移的黑色素瘤提供新的治療方向。 目的 一.檢測含全長小鼠內(nèi)皮抑素基因和綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的體外生物學(xué)活性，并進(jìn)一步探討內(nèi)皮抑素的作用機(jī)理； 二.檢測內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，選擇合適的基因治療皮膚黑色素瘤的條件； 三.觀測內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)對(duì)

3、小鼠的平均成瘤時(shí)間、成瘤率等的影響； 四.觀測內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)的內(nèi)皮抑素對(duì)黑色素瘤的治療作用，并進(jìn)一步探討其抗腫瘤機(jī)理。 內(nèi)容和方法 一.在HEK293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增腺病毒，利用GFP的特性評(píng)估小量擴(kuò)增的腺病毒滴度；經(jīng)CsCl密度梯度濃縮及50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定大量擴(kuò)增的腺病毒滴度。 二.不同MOI(感染復(fù)度)的Ad-GFP感染ECV304細(xì)胞(人血管內(nèi)皮細(xì)胞)和B16F10黑色素瘤細(xì)胞，熒光

4、顯微鏡下觀察腺病毒載體體外對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。用RT-PCR法和WesternBlot法分別檢測Ad-mES轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后內(nèi)皮抑素基因的mRNA表達(dá)、培養(yǎng)上清中內(nèi)皮抑素蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步用ELISA檢測試劑盒測定其表達(dá)量。 三.MTT法檢測內(nèi)皮抑素腺病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后細(xì)胞增殖的變化，檢測Ad-mES轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長刺激因子VEGF的阻斷作用。用流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮抑素腺病毒表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞周期影響和致凋亡效應(yīng)，并進(jìn)一步用A

5、nnexinV-FITC法檢測細(xì)胞早期凋亡變化。 四.根據(jù)腫瘤組織冰凍切片上GFP陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，評(píng)估了內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。 五.隨機(jī)將24只C57BL/6小鼠均分為3組。即mES、GFP(接種MOI=500時(shí)，Ad-mES、Ad-GFP分別轉(zhuǎn)染的B16F10細(xì)胞)和瘤細(xì)胞組(接種未轉(zhuǎn)染的B16F10細(xì)胞)，接種細(xì)胞數(shù)均為106/ml，種于背部右側(cè)。觀察腫瘤生成時(shí)間及體積變化并HE染色觀察腫瘤組

6、織病理。 六.觀測Ad-mES對(duì)小鼠黑色素瘤的治療效果。建立小鼠黑色素瘤模型，腫瘤細(xì)胞接種兩周后體積長到200-300mm3隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。治療組分Ad-mES單劑組和重復(fù)組(各20只)；對(duì)照組分PBS組、Ad-GFP組(各10只)；基因治療方法：Ad-mES單劑組、PBS組、Ad-GFP組分別瘤內(nèi)緩慢注射3.16×1010pfu/mlAd-mES、PBS和3.98×1010pfu/ml的Ad-GFP各0.1ml/只，每

7、只小鼠一次；Ad-mES重復(fù)組每隔7天瘤內(nèi)注射上述滴度的Ad-mES。免疫組化檢測內(nèi)皮抑素蛋白腫瘤組織內(nèi)原位表達(dá)，WesternBlot法觀測注射后蛋白表達(dá)持續(xù)時(shí)間，ELISA試劑盒檢測血循環(huán)中內(nèi)皮抑素蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用CD31和CD105兩種抗原標(biāo)記免疫組化作腫瘤血管密度計(jì)數(shù)，觀察治療后腫瘤血管密度變化。 七.觀察內(nèi)皮抑素腺病毒載體對(duì)小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，生存率變化，并進(jìn)行生存分析。 八.電鏡觀察治療后腫瘤細(xì)胞凋亡

8、情況，初步分析內(nèi)皮抑素抗腫瘤的機(jī)理。 研究結(jié)果 一.制備腺病毒的滴度：小量擴(kuò)增3.25×107pfu/ml；大量擴(kuò)增的Ad-mES為3.16×1010pfu/ml，Ad-GFP為3.98×1010pfu/ml。 二.腺病毒載體可有效轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。MOI為10，20，50，100，200，500的Ad-GFP在B16F10細(xì)胞和ECV304細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為15.6％、35％、73％、88％、95.2％、

9、97％和19％、35％、80％、90％、97％、98.5％。MOI=100時(shí)，RT-PCR法在Ad-mES轉(zhuǎn)染的B16F10和ECV304細(xì)胞內(nèi)均檢測到了內(nèi)皮抑素mRNA；WesternBlot法在上述細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中均檢測到了內(nèi)皮抑素蛋白表達(dá)；ELISA試劑盒測定Ad-mES轉(zhuǎn)染B16F10和ECV304細(xì)胞后的培養(yǎng)上清中內(nèi)皮抑素蛋白濃度分別達(dá)3170±486ng/ml、2008±381ng/ml。上述方法在病毒和PBS對(duì)照的結(jié)果均

10、為陰性。 三.Ad-mES可明顯抑制ECV304細(xì)胞的增殖，相對(duì)于PBS組和GFP組，MOI=10、100時(shí)，抑制率最高分別為52.41％、50.4％和80.53％、79.72％。而對(duì)B16F10腫瘤細(xì)胞的增殖沒有抑制效果。 四.MOI=100時(shí)，Ad-mES作用的ECV304實(shí)驗(yàn)組在不同的時(shí)相均有凋亡峰出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)染后12小時(shí)即出現(xiàn)凋亡，48小時(shí)最明顯，位于G1期的細(xì)胞增多，S期和G2M期細(xì)胞減少，同時(shí)亞G1期細(xì)胞(凋

11、亡細(xì)胞)增多，與兩對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。對(duì)照病毒載體Ad-GFP與PBS組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Ad-mES對(duì)B16F10的細(xì)胞周期無明顯影響(P＞0.05)。AnnexinV-FITC法檢測發(fā)現(xiàn)Ad-mES轉(zhuǎn)染后24h就可誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞的凋亡，凋亡率為18.6±3.2％，至48小時(shí)平均至49.2±6.5％，這種作用隨時(shí)間延長逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)，最多達(dá)75.19％；而空載體組、PBS作用ECV30

12、4組及Ad-mES、空載體組、PBS作用B16F10組則沒有明顯的凋亡。 五.應(yīng)用Ad-mES治療小鼠黑色素瘤時(shí)，取MOI=500、瘤內(nèi)注射和間隔7天后給藥Ad的體內(nèi)轉(zhuǎn)染率最高，可達(dá)到37.33％。 六.在該系統(tǒng)對(duì)黑色素瘤成瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，瘤細(xì)胞組、GFP組和mES組小鼠平均成瘤時(shí)間分別為7.87±0.64、8.00±0.76和10.25±2.55，mES組分別與前2組比較，P=0.018、0.025；mES組與

13、瘤細(xì)胞組、GFP組相比，小鼠荷瘤第5天、10d、15d時(shí)，P值均＜0.05，在小鼠荷瘤5天、10天、15天，相對(duì)于瘤細(xì)胞組、GFP組，mES組的抑瘤率分別為41.7％、36.5％;39.5％、58.7％;42.3％、42.5％。普通病理光鏡下瘤細(xì)胞組和GFP組腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，血管豐富，尤腫瘤邊緣區(qū)域更為明顯。mES組腫瘤血管不規(guī)則，扭曲并可見到壞死區(qū)，管腔口徑不一，有的腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，組織內(nèi)少量炎癥細(xì)胞存在。 七.基因治療結(jié)果

14、，對(duì)照組Ⅰ、Ⅱ在治療后16天、18天始有小鼠死亡；治療組Ⅰ、Ⅱ小鼠均在治療后20天始有死亡。內(nèi)皮抑素腺病毒載體注射后一周免疫組化顯示黑色素瘤組織內(nèi)ES強(qiáng)陽性表達(dá)，對(duì)照組則呈陰性或痕量表達(dá)。WesternBlot顯示單次Ad-mES組內(nèi)皮抑素表達(dá)可持續(xù)一個(gè)月。ELISA試劑盒檢測治療一周后內(nèi)皮抑素就可達(dá)到640±230ng/ml，兩周后為1120±360ng/ml，一月后降到與基礎(chǔ)量相當(dāng)水平。 八.透射電鏡下觀察治療后兩周小鼠的腫

15、瘤組織，內(nèi)皮抑素基因治療組微血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡表現(xiàn)，另外腫瘤細(xì)胞也有凋亡，但對(duì)照組沒有靶細(xì)胞的明顯凋亡。治療組Ⅰ、Ⅱ和對(duì)照組Ⅰ、Ⅱ腫瘤組織血管經(jīng)CD31抗體標(biāo)記的平均血管密度(MVD)分別為171.6±42.6，165.4±37.4，39.3±7.4和17.4±3.7，經(jīng)CD105抗體標(biāo)記的平均血管密度分別為43.6±4.8、39.7±5.6、17.5±3.8和9.5±4.2。治療組和對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，空病毒對(duì)照組與PBS

16、陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 一.小鼠內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)可在體內(nèi)、體外高效表達(dá)分泌型的有生物學(xué)活性的內(nèi)皮抑素蛋白。 二.內(nèi)皮抑素基因腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)可高效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。體外轉(zhuǎn)染可使ECV304細(xì)胞G1期阻滯并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制其增殖，且能阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的作用；對(duì)腫瘤細(xì)胞無影響。 三.瘤內(nèi)注射內(nèi)皮抑素腺病毒載體后可顯著延長小鼠的平均成瘤時(shí)間，抑制黑色素瘤生長，減少轉(zhuǎn)