條件增殖腺病毒介導(dǎo)IL-18靶向治療惡性黑色素瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 研究攜帶IL-18基因的條件增殖型腺病毒ZD55-IL-18在人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)A375細(xì)胞荷瘤鼠的生長(zhǎng)抑制作用并初步探討其機(jī)制，為進(jìn)一步研究IL-18的抗腫瘤機(jī)制和臨床應(yīng)用ZD55-IL-18靶向治療惡性黑色素瘤奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.體外實(shí)驗(yàn) 1.1 體外培養(yǎng)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株，ZD55-IL-18、ZD55-EGFP與Ad-IL-18感染A375細(xì)胞。

2、 1.2 熒光顯微鏡、結(jié)晶紫染色法觀察ZD55-IL-18對(duì)A375的細(xì)胞病作用。 1.3 通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)IL-18基因mRNA的表達(dá)。 1.4 Western blot檢測(cè)腺病毒ElA、IL-18蛋白的表達(dá)情況。 1.5 TNUEL法檢測(cè)ZD55-IL-18誘導(dǎo)A375細(xì)胞的凋亡情況。 1.6 MTT法檢測(cè)ZD55-IL-18對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

3、 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 2.1 體外培養(yǎng)人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株，建立裸鼠人惡性黑色素瘤移植瘤模型。 2.2 移植瘤瘤體內(nèi)分別注射病毒ZD55-IL-18、Ad-IL-18、ZD55-EGFP及PBS，病毒每次注射7×108PFU，連續(xù)注射三天。 2.3 期測(cè)量腫瘤體積并于接種44 d后切除腫瘤組織稱重觀察腫瘤生長(zhǎng)抑制情況。 2.4 切取腫瘤進(jìn)行HE染色觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。 2.5 免疫組織化學(xué)

4、法檢測(cè)腫瘤組織E1A、IL-18、CD34、VEGF蛋白表達(dá)。 2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)移植瘤組織E1A及IL-18蛋白表達(dá)。 2.7 TUNEL法檢測(cè)移植瘤組織凋亡情況。 2.8 取裸鼠肝臟、肺臟行病理學(xué)檢測(cè)觀察移植瘤轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果: 1.體外實(shí)驗(yàn) 1.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ZD55-IL-18、ZD55-EGFP與Ad-IL-18感染A375細(xì)胞5天后，對(duì)A375細(xì)胞均有殺

5、傷作用。MOI=1時(shí)，ZD55-IL-18可以將A375細(xì)胞全部殺滅，而ZD55-EGFP、Ad-IL-18的殺傷作用較弱，達(dá)到相同殺傷效應(yīng)ZD55-EGFP、Ad-IL-18的MOI值分別為10、100。 1.2 ZD55-EGFP增加外源基因在A375細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)感染1d后，ZD55-EGFP和Ad-EGFP感染的A375細(xì)胞中都只有很弱的熒光蛋白表達(dá)。但3天后，ZD55-EGFP感染的A375細(xì)胞中大多細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞

6、病變且熒光蛋白表達(dá)量顯著增加，明顯高于Ad-EGFP感染的細(xì)胞 1.3 RT-PCR結(jié)果表明：ZD55-IL-18、ZD55-EGFP與Ad-IL-18感染A375細(xì)胞48h后，IL-18mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的(479.08±8.92)％、(211.79±6.24)％、(372.73±7.56)％，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 1.4 Western blot顯示：病毒ZD55-IL-18、ZD55-EGFP

7、與Ad-IL-18感染A375細(xì)胞48h后，IL-18蛋白表達(dá)分別是對(duì)照組的(1619.36±17.92)％、(422.08±6.38)％、(1139.52±15.27)％，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ZD55-IL-18處理組、ZD55-EGFP處理組可以檢測(cè)到E1A的表達(dá)，Ad-IL-18處理組沒有E1A的表達(dá)，表明ZD55-IL-18可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖。 1.5 TUNEL凋亡：ZD55-IL-18、ZD55-EG

8、FP與Ad-IL-18、對(duì)照組各組凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率分別為(62.73±2.93)％、(50.66±1.79)％、(22.54±3.26)％、(12.23±2.83)％。各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ZD55-IL-18與其它各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 1.6 MTT法檢測(cè)結(jié)果說明：ZD55-IL-18可以明顯抑制A375細(xì)胞增殖：(1) 用MOI=10的ZD55-IL-18、、ZD55-EGFP與Ad-

9、IL-18感染A375細(xì)胞，4d后存活率分別為(37.6±1.31)％、(44.7±1.52)％、(66.7±1.53)％，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2) 感染4d后，MOI=0.1、1、10、100時(shí)ZD55-IL-18處理組細(xì)胞存活率分別為(76.9±1.15)％、(55.6±2.82)％、(37.6±1.31)％、(16.5±1.11)％，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

10、 2.1 成功建立裸鼠人惡性黑色素移植瘤模型。 2.2 瘤內(nèi)注射不同病毒44 d后ZD55-IL-18組腫瘤體積為(1039.378±29.67)mm3，ZD55-EGFP組腫瘤體積為(1839.22±52.88)mm3，Ad-IL-18組為(2900.46±62.65)mm3，PBS組為(3980.24±63.78)mm3，各組間有顯著性差異(P<0.05)；接種44 d后ZD55-IL-18組、ZD55-EGFP組、Ad-

11、IL-18組和PBS組最終平均瘤重分別為(1.149±0.503)g、(2.98±1.151)g、(4.55±1.046)g、(6.422±0.934)g，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.3 E1A蛋白免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在PBS處理組與Ad-IL-18處理組無E1A蛋白的表達(dá)，而ZD55-IL-18、ZD55-EGFP處理組有大量E1A蛋白的表達(dá)；IL-18蛋白表達(dá)強(qiáng)弱依次為ZD55-IL-18處理組(9

12、0.25±3.75)％>Ad-IL-18處理組(73.37±1.87)％>ZD55-EGFP處理組(35.27±2.74)％>PBS處理組(18.27±2.85)％，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD34蛋白免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PBS處理組(87.78±2.54)％>Ad-IL-18處理組(58.73±2.23)％>ZD55-EGFP處理組(25.43±1.35)％>ZD55-IL-18處理組(15.54±3.52)％，

13、各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：VEGF蛋白的表達(dá)量PBS處理組(84.67±1.64)％>Ad-IL-18處理組(60.34±2.78)％>ZD55-EGFP處理組(23.27±1.87)％>ZD55-IL-18處理組(14.26±2.49)％，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.4 激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示，E1A蛋白在ZD55-IL-18處理組及ZD55-EGFP處理組示熒光陽(yáng)性，說明有E1A蛋白表

14、達(dá)，顯示病毒復(fù)制，而Ad-IL-18和PBS處理組示熒光陰性。IL-18蛋白熒光強(qiáng)弱依次為：ZD55-IL-18處理組>Ad-IL-18處理組>ZD55-EGFP處理組>PBS處理組。 2.5 凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：不同處理組移植瘤細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率依次為：ZD55-IL-18處理組平均為(86.28±3.25)％；ZD55-EGFP處理組平均為(64.43±4.34)％；Ad-IL-18處理組平均為(43.67±3.46)％；PBS處

15、理組平均為(10.73±2.48)％。各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.6 各處理組肝臟及肺臟HE染色切片顯示肝臟均正常，未示有移植瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。PBS組肺臟全部發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移百分率為100％，Ad-IL18組肺臟轉(zhuǎn)移兩只，ZD55-IL18處理組及ZD55-EGFP處理組未發(fā)生腫瘤肺轉(zhuǎn)移。 結(jié)論: ZD55-IL-18可在A375細(xì)胞中體內(nèi)外增殖且高效表達(dá)IL-18基因并能誘導(dǎo)A375細(xì)胞的凋亡、抑制惡