蛋白質(zhì)構(gòu)象以及分子間非共價(jià)相互作用的冷噴霧質(zhì)譜研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能有著緊密的聯(lián)系。蛋白質(zhì)通過(guò)分子內(nèi)非共價(jià)鍵作用折疊形成蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，這其中可能包含多種不同的構(gòu)象體；同時(shí)蛋白質(zhì)還常與其它分子形成非共價(jià)復(fù)合物，這些都是蛋白質(zhì)行使不同生物功能的基礎(chǔ)。因此，表征蛋白質(zhì)構(gòu)象及其復(fù)合物結(jié)構(gòu)是從分子水平上闡述生命現(xiàn)象、藥物機(jī)理的重要基礎(chǔ)，并可為藥物篩選提供依據(jù)。質(zhì)譜技術(shù)，尤其是電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(ESI—MS)在該領(lǐng)域的應(yīng)用日益受到重視，然而ESI的離子化條件使其在表征非共價(jià)相互作用方面存在一定局

2、限性。為了解決這一難題，本研究利用冷噴霧質(zhì)譜技術(shù)(CSI—MS)的低溫噴霧有利于保持溶液中非共價(jià)相互作用的特點(diǎn)，通過(guò)考察CSI—MS譜的電荷價(jià)態(tài)分布，建立了能夠表征蛋白質(zhì)天然活性構(gòu)象及其與小分子藥物非共價(jià)復(fù)合物的新型CSI—MS分析方法。另外，探索并建立了有機(jī)鹽類藥物快速、簡(jiǎn)便的CSI—MS新檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)鹽類藥物形成整體簇合物結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜表征。本論文研究的具體內(nèi)容主要包括四部分： 1.表征蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的CSI—MS分析方

3、法研究。 通過(guò)考察噴霧電壓、錐孔電壓、噴霧溫度等關(guān)鍵儀器參數(shù)及溶劑表面張力等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于表征蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，合理選擇儀器參數(shù)及溶液條件，建立了在酸性水體系條件下開(kāi)展蛋白質(zhì)天然構(gòu)象研究的CSI—MS分析方法。結(jié)果表明，儀器參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)CSI—MS譜產(chǎn)生一定的影響，其中，錐孔電壓和噴霧溫度的影響比較明顯。此外，不同溶劑表面張力的研究結(jié)果證明及支持了溶劑表面張力對(duì)蛋白質(zhì)電荷價(jià)態(tài)分布不產(chǎn)生影響的觀點(diǎn)。同時(shí)表明純水溶劑以外的其他不同溶劑

4、表面張力體系中，雷利方程對(duì)蛋白質(zhì)最大電荷價(jià)態(tài)的預(yù)測(cè)具有不合理性。 2.酸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及復(fù)合物的CSI—MS研究。 系統(tǒng)考察了不同pH值的溶液體系中三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素c、泛素、肌紅蛋白)以及親環(huán)蛋白A(免疫抑制劑靶蛋白)等的CSI—MS譜，并對(duì)CSI—MS譜和ESI—MS譜進(jìn)行了細(xì)致的比較分析，開(kāi)展了酸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變的定量研究。此外，利用CSI—MS方法實(shí)現(xiàn)了親環(huán)蛋白A與其小分子配基環(huán)孢素所形成的非共價(jià)

5、復(fù)合物的表征。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)CSI—MS譜的電荷價(jià)態(tài)分布窄，且平均或最高價(jià)態(tài)低；CSI—MS技術(shù)的低溫噴霧等特點(diǎn)能夠更好地維持及反映蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，可以比較真實(shí)地表征蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化，同時(shí)可觀察到完整的蛋白復(fù)合物。另外，細(xì)胞色素c在pH2.0-3.0范圍內(nèi)通常存在雙模式峰分布，利用CSI—MS方法定量分析其折疊平衡轉(zhuǎn)變，所得結(jié)果與其它光譜數(shù)據(jù)相吻合。表明CSI—MS能準(zhǔn)確定量分析蛋白質(zhì)的折疊平衡轉(zhuǎn)變情況。 3.表征Aβ

6、蛋白與DactylorhinB非共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的CSI—MS方法研究。 β—淀粉樣蛋白(Aβ)是阿爾茨海默癥(AD)患者腦中老年斑的重要組分，本研究考察了Aβ1—40的“老化”過(guò)程，利用CSI—MS分析方法獲得了Aβ1—40蛋白構(gòu)象及聚合物隨時(shí)間變化的相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)了Aβ1—40與抗AD活性天然產(chǎn)物DactylorhinB(DHB)形成的非共價(jià)復(fù)合物。同時(shí)重點(diǎn)考察了DHB對(duì)Aβ1—40構(gòu)象及其聚合物的影響，證明了DHB能夠在一定

7、程度上抑制Aβ1—40蛋白的聚合，為解釋其藥效作用機(jī)制提供了一定科學(xué)依據(jù)。 4.表征有機(jī)鹽類藥物整體結(jié)構(gòu)的CSI—MS方法研究。 選擇了幾種類型的有機(jī)鹽類藥物，包括硫酸鹽類、磺酸鹽類及鹽酸鹽類等，對(duì)其進(jìn)行了CSI—MS中關(guān)鍵測(cè)定參數(shù)和溶液條件的系統(tǒng)考察。在正離子檢測(cè)模式的CSI—MS譜中，發(fā)現(xiàn)這些鹽類藥物主要以1:1或者2：1比例結(jié)合形成特征的簇合物離子。本研究證明CSI—MS方法能有效地表征鹽類藥物的整體結(jié)構(gòu)，從而建立