P120-catenin亞型1調(diào)節(jié)E-adherin表達及對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、P120-catenin(p120ctn)是catenin家族的重要成員。它可以通過與E-cadherin(E-cad)直接結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。但是,由于p120ctn亞型的存在,不同亞型的p120ctn對細(xì)胞黏附的作用還存在較大爭議。同時,p120ctn在細(xì)胞黏附中發(fā)揮的作用還可能受到E-cad表達位置的影響。因此,p120ctn不同亞型在肺癌細(xì)胞黏附中是怎樣發(fā)揮作用的,其功能與E-cad表

2、達位置具有怎樣的關(guān)系,p120ctn調(diào)節(jié)E-cad表達可能的功能區(qū)域在什么位置等,目前尚不十分清楚,為此,本研究篩選了E-cad不同亞細(xì)胞定位的肺癌細(xì)胞系,通過雙向調(diào)控p120ctn及亞型的表達,探討p120ctn不同亞型在細(xì)胞黏附中的作用以及P120ctn調(diào)節(jié)E-cad表達的可能功能區(qū)域。
　　 實驗材料和方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)在37℃,含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人類腫腺癌細(xì)胞系SPC和人類大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460

3、,培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清,2.3g/L NaHCO3,100units/ml青鏈霉素的RPMI1640(Invitrogen,美國)培養(yǎng)液中,貼壁生長,每2-3天用0.25％胰酶(Invitrogen,美國)消化傳代。
　　 2、Western Blot將含80μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,單克隆抗體p120ctn,E-cad或GFP4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育2小時后E

4、CL顯色。
　　 3、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染將分別含有目的基因的載體導(dǎo)入感受態(tài)宿主細(xì)菌DH5α中擴增、純化,測序驗證后,使用Lipofect2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系中,通過Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染效果。
　　 4、Transwell方法檢測細(xì)胞侵襲能力按照BD公司說明操作,取100μl細(xì)胞懸液(5×106個/ml)滴入上室內(nèi),下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,上下室之間用孔徑為8μm的

5、聚碳酸酯微孔濾膜分開,將小室置37℃,5％CO2條件下放置后,棄去上室內(nèi)液體,擦盡膜上Matrigel膠,100％甲醇固定30分鐘,常規(guī)蘇木素染色,光鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)。
　　 5、間接免疫熒光檢測固定后的細(xì)胞爬片用0.2％ Triton X-100處理15分鐘,非免疫動物血清封閉,一抗為單克隆抗體mouse anti-E-cad4℃孵育過夜;二抗為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記或羅丹明標(biāo)記(TRITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,碘化

6、丙啶或DAPI進行核復(fù)染。50％緩沖甘油封片,熒光顯微鏡Olympus IX51于波長為527nm處觀察羅丹明熒光強度,于372nm波長處觀察DAPI的熒光染色觀察并照相。陰性對照實驗:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。
　　 結(jié)果：
　　 1、干擾肺癌細(xì)胞系中p120ctn的表達可以下調(diào)E-cad蛋白水平,但對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響依E-cad的不同定位而不同。
　　 在E-cad和p120ctn均定

7、位于細(xì)胞連接處的H460肺癌細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染p120ctn干擾質(zhì)粒后,Western Blot及免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)E-cad表達蛋白減少,并且E-cad在細(xì)胞連接處表達消失,胞漿處可以檢測到微量的E-cad表達,同時,Transwell侵襲實驗證實細(xì)胞侵襲能力增強。相反,在E-cad和p120ctn均定位于胞漿的SPC細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染p120ctn干擾質(zhì)粒后,Western Blot及免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)SPC細(xì)胞胞漿中E-cad蛋白表達減少,并

8、且細(xì)胞侵襲能力減弱。
　　 2、p120ctn亞型1和亞型3對E-cad有著不同的調(diào)節(jié)作用。
　　 H460及SPC肺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染p120ctn干擾質(zhì)粒后,再分別轉(zhuǎn)染p120ctn亞型1及亞型3質(zhì)粒,我們發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染p120ctn亞型1的質(zhì)粒后,E-cad蛋白表達增高,E-cad重新恢復(fù)其在細(xì)胞連接處的表達,Transwell侵襲實驗證實細(xì)胞侵襲能力減弱;而轉(zhuǎn)染p120ctn亞型3質(zhì)粒后,E-cad表達水平

9、雖沒有改變,但仍可恢復(fù)其侵襲能力。而在SPC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染p120ctn亞型1質(zhì)粒后,E-cad蛋白表達水平上調(diào),同時細(xì)胞侵襲能力增強;而轉(zhuǎn)染p120ctn亞型3質(zhì)粒后,E-cad蛋白水平無變化,但細(xì)胞侵襲能力得到一定程度的恢復(fù)。
　　 3、p120ctn亞型1對E-cad的調(diào)節(jié)作用依賴于其N-末端的1-54位氨基酸序列H460和SPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染干擾p120ctn質(zhì)粒后,再分別轉(zhuǎn)染p120ctn亞型1的5種剪切體質(zhì)粒,其中只有含有

10、N-末端1-54位氨基酸序列的M5剪切體質(zhì)?？梢允笶-cad蛋白表達上調(diào),其它剪切體對E-cad的表達無調(diào)節(jié)作用,并且轉(zhuǎn)染M5剪切體質(zhì)粒后,能夠恢復(fù)H460細(xì)胞中E-cad在細(xì)胞連接處的表達,細(xì)胞的侵襲能力減弱;而SPC細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染M5剪切體質(zhì)粒雖然能夠使E-cad在胞漿中的表達升高,但不能使E-cad表達于細(xì)胞連接處,同時細(xì)胞的侵襲能力增強。
　　 結(jié)論：
　　 1.E-cad在細(xì)胞中的表達和定位受到p120ctn亞