Dishevelled-1，3分別通過β-catenin和p120ctn影響肺癌細胞侵襲并與不良預后相關.pdf

1、目的：
　　 腫瘤的形成與發(fā)展是一個多基因、多步驟、多階段的病理過程,有眾多的信號傳導通路參與這一過程。其中Wnt通路的作用,日益受到人們的重視。Dishevelled(Dvl)是Wnt通路中位于上游的正向調(diào)節(jié)因子,介導Wnt信號在細胞內(nèi)的三條通路,即Wnt/β-catenin通路,非經(jīng)典Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。人類Dishevelled(Dvl)家族有Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3三個成員,在非小細胞肺癌

2、中均存在過表達,但他們與患者預后的關系尚不清楚,不同亞型對肺癌細胞侵襲能力的影響和可能的機制也需要進一步研究和證實。
　　 方法
　　 1、材料
　　 80例原發(fā)性非小細胞肺癌患者的組織標本收集自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科1998-2005年存檔蠟塊。全部標本均有術后隨訪記錄。標本經(jīng)4％中性甲醛固定,石蠟包埋,HE常規(guī)染色后明確診斷。
　　 2、免疫組織化學染色及結果判定
　　 標本用中性福爾

3、馬林溶液固定,石蠟包埋,制成4μm切片,經(jīng)脫蠟,脫苯,水化后,采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測Dvl-1,Dvl-3,β-catenin和p120ctn蛋白表達。單克隆抗體小鼠抗人Dvl-1,Dvl-3單克隆抗體,鼠抗人β-catenin單克隆抗體,鼠抗人p120ctn單克隆抗體4℃孵育過夜。以正常支氣管粘膜上皮細胞著色強度和定位為內(nèi)對照,PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。選腫瘤細胞陽性染色集中區(qū)域,每張切片計

4、數(shù)400個癌細胞,由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測。Dvl判定標準:我們將陽性細胞數(shù)<10％定為正常表達(negtive-),而將≥11％定為異常表達(positive+)。β-catenin判定標準:正常上皮組織中陽性表達并定位于細胞膜,我們將膜陽性瘤細胞數(shù)≤90％定為膜表達降低,膜表達降低和胞漿出現(xiàn)陽性統(tǒng)歸為異常表達。p120ctn判定標準:p120ctn正常表達定位于細胞膜,我們將膜表達細胞數(shù)<90％或胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒統(tǒng)歸為異常表達。

5、r>　　 3、RT-PCR
　　 采用TrizolTM試劑提取肺癌組織或培養(yǎng)細胞的總RNA,利用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進行反轉錄。分別擴增Dvl-1、Dvl-3、p120ctn和β-catenin,以β-actin為內(nèi)參。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后,成像分析。
　　 4、Western Blot
　　 將含80μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳后,轉印至PVDF膜

6、,單克隆抗體Dvl-1,Dvl-3,β-catenin和p120ctn 4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1h后DAB或ECL顯色。
　　 5、細胞培養(yǎng)
　　 在37℃,含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人類肺癌細胞系LTEP-α-2和A549細胞系,培養(yǎng)基為含10％滅活胎牛血清的RPMI 1640,貼壁生長,每2-3天胰酶消化傳代一次。
　　 6、質(zhì)粒構建與轉染
　　 將含有目的基因的載體導入感受態(tài)

7、宿主細菌DH5α中擴增、純化,測序驗證后,使用Lipofectamine 2000轉染試劑將質(zhì)粒分別轉染至肺癌細胞系LTEP-α-2和A549中培養(yǎng),通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉染效果。
　　 7、Dual-luciferase Asssay
　　 按Lipofectamine2000轉染試劑操作說明進行轉染,將細胞種植于24孔板,并分別以pGL3-OT或pGL3-OF(0.5μg)報告基因質(zhì)粒瞬時轉

8、染,共轉染內(nèi)對照質(zhì)粒pRL-TK(50ng),37℃培養(yǎng)30hr。用雙螢光報告檢測試劑檢測報告基因表達情況,Tc價導的基因轉錄活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示,螢光素酶活性數(shù)值分別以pRL-TK報告質(zhì)粒的海腎素活性校正。為分析Dvl對β-catenin的影響,共轉染pCS2-Myc-Dvl1或pMyc-cyto-Dvl3(0.5μg),并以空質(zhì)粒pCS2+或pMyc-cyto(0.5μg)控制質(zhì)粒量。
　　 8、體外

9、基質(zhì)膠侵襲實驗檢測細胞侵襲能力
　　 按照BD公司說明操作,取100μl細胞懸液(5×106個/ml)滴入上室內(nèi),下室加入含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開,將小室置37℃,5％CO2條件下放置后,棄去上室內(nèi)液體,擦盡膜上Matrigel膠,100％甲醇固定30分鐘,常規(guī)蘇木素染色,光鏡下計數(shù)細胞數(shù)。
　　 9、統(tǒng)計分析
　　 各組資料利用SPSS for

10、 Window 13.0進行統(tǒng)計分析。p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1、正常支氣管上皮細胞的Dvl蛋白呈陰性表達,而在肺癌組織中,Dvl-1、3均存在過表達,陽性信號主要定位于胞漿,為彌漫分布。正常支氣管上皮細胞p120ctn、β-catenin表達為細胞膜陽性,而在肺癌組織中主要表現(xiàn)為膜表達減弱或出現(xiàn)胞質(zhì)異位表達。Dvl-1和Dvl-3在腺癌的陽性率均高于鱗癌,Dvl-1、Dvl-3過表達和β-cate

11、nin及p120ctn的異常表達均與NSCLC的低分化有關。有淋巴結轉移的肺癌,其Dvl-3的陽性率和β-catenin及p120ctn的異常表達率顯著高于未轉移者。在Ⅲ-Ⅳ期患者中,Dvl-1及Dvl-3的陽性率和p120ctn的異常表達率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期。
　　 2、肺癌組織中Dvl-1的過表達與β-catenin異常表達相關,而Dvl-3的過表達與p120ctn異常表達相關,與β-catenin表達卻無相關性。
　　

12、 3、80例有完整隨訪資料的非小細胞肺癌,經(jīng)Log-rank檢驗,其Dvl-3及p120ctn正常表達者與異常表達者平均生存時間差異存在統(tǒng)計學意義。而Dvl-1過表達和β-catenin的異常表達與生存時間未發(fā)現(xiàn)有意義的差異。將各病理因素輸入Cox比例風險回歸模型,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)Dvl-3過表達、p120ctn異常表達、TNM分期及淋巴結轉移為影響NSCLC預后的獨立風險因素。
　　 4、選擇Dvl-2穩(wěn)定表達,而Dvl-1和Dv

13、l-3低表達的A549和LTEP-α-2肺腺癌細胞系,分別轉染Dvl-1和Dvl-3,RT-PCR顯示轉染前后β-catenin mRNA水平變化不明顯,但Western blotting結果與未轉染和空質(zhì)粒組對比顯示,轉染Dvl-1肺癌細胞系的β-catenin蛋白表達上調(diào),而轉染Dvl-3肺癌細胞系的β-catenin蛋白表達下調(diào)。采用pGL3-OT/OF螢光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),過表達Dvl-1增強肺腺癌細胞β-catenin依賴

14、的Tcf轉錄活性,而過表達Dvl-3抑制肺腺癌細胞β-catenin依賴的Tcf轉錄活性。
　　 5、在A549和LTEP-α-2肺癌細胞中過表達Dvl-1、Dvl-3均使p120ctn蛋白表達增高。RT-PCR結果顯示,轉染Dvl-1后,p120ctn mRNA變化不明顯,而轉染Dvl-3可明顯增高p120ctn mRNA水平。
　　 6、分別轉染Dvl-1和Dvl-3后,A549細胞及LTEP-α-2細胞侵襲至濾膜表

15、面的腫瘤細胞數(shù)均明顯高于空質(zhì)粒組。轉染Dvl-1并加入β-catenin抗體(100ng/ml)18h后,轉染Dvl-3并加入p120ctn抗體(100ng/ml)18h后,細胞對基質(zhì)膠的侵襲穿透能力均受到明顯抑制。而轉染Dvl-1并加入p120ctn抗體(100ng/ml)以及轉染Dvl-3并加入β-catenin抗體(100ng/ml),卻未發(fā)現(xiàn)對細胞的侵襲能力有明顯的影響,因此Dvl-1通過β-catenin,而Dvl-3則可能通

16、過p120ctn增強肺腺癌細胞侵襲能力。
　　 結論
　　 1、肺癌中不僅存在著Dvl-1和Dvl-3的過表達,而且其異常表達與NSCLC的分型、分化、淋巴結轉移和TNM分期相關。
　　 2、Dvl-1過表達與β-catenin異常表達相關,Dvl-3過表達與p120ctn異常表達及肺癌的不良預后正相關,并可作為影響肺癌預后的獨立危險因素。
　　 3、Dvl-1通過經(jīng)典的Wnt信號通路促進肺癌細胞侵襲能力