p120ctn對Kaiso的調(diào)控及兩者在肺癌中作用的研究.pdf

1、作為Armadillo蛋白亞家族中的重要成員之一的p120-catenin(p120ctn)一直被認(rèn)為是E—cadherin/catenin黏附復(fù)合物的重要調(diào)節(jié)因子。同時，p120ctn也是小GTP酶的重要調(diào)節(jié)因子，它可以在細(xì)胞漿中通過調(diào)節(jié)小GTP酶的活性狀態(tài)來調(diào)控細(xì)胞骨架的裝配，它在細(xì)胞黏附以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面的作用已經(jīng)受到人們的廣泛重視。大量研究表明，p120ctn的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著研究的深入，特別是

2、核轉(zhuǎn)錄因子Kaiso的發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)p120ctn還可以作為一種信號分子穿梭于核/漿之間，通過影響核轉(zhuǎn)錄因子Kaiso調(diào)控基因表達(dá)。 本研究目的旨在探討肺癌組織中p120ctn和Kaiso的表達(dá)情況及與臨床病理學(xué)參數(shù)意義、肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。在細(xì)胞水平上，應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)研究Kaiso的核內(nèi)功能，通過穩(wěn)定干擾和過表達(dá)p120ctn的表達(dá)，分析p120ctn亞型蛋白1和3對Kaiso表達(dá)和定位的影響。運(yùn)用細(xì)胞周期同步化技術(shù)探

3、討細(xì)胞周期對Kaiso核漿分布的影響。 方法： 1、肺癌組織 原發(fā)性肺癌標(biāo)本及配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌均來自中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院外科1998—2005年手術(shù)切除的標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。其中部分患者保存有完整、詳實的預(yù)后資料。標(biāo)本經(jīng)4％中性甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色后明確診斷。其中部分癌旁肺組織(遠(yuǎn)離腫瘤至少5厘米)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌離體后立即放入液氮后—70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2、免疫組織化學(xué)

4、染色及結(jié)果判定 標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白—過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測Kaiso和p120ctn蛋白表達(dá)。單克隆抗體Kaiso和p120ctn4℃孵育過夜。以癌旁肺支氣管粘膜上皮細(xì)胞著色強(qiáng)度和定位為內(nèi)對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。結(jié)果判定：高倍視野(×400)下選陽性信號最強(qiáng)區(qū)域計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，按Kaiso表達(dá)百分率分為以

5、下四個等級：<25％為0分，26％—50％為1分，51％—75％為2分，>75％為3分。根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度分為三個等級：淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。以陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分，積分為0和1分者判定為陰性，積分>2為陽性。當(dāng)Kaiso核陽性信號≥5％時定為核陽性表達(dá)。P120ctn正常表達(dá)的陽性信號定位于細(xì)胞膜，表現(xiàn)為膜著色清楚、連續(xù)且陽性細(xì)胞數(shù)≥90％；膜表達(dá)下降表現(xiàn)為膜著色淡且不連續(xù)，陽性細(xì)

6、胞數(shù)<90％；而超過10％的腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)陽性信號定為異位表達(dá)。P120ctn的異位表達(dá)和膜表達(dá)下降統(tǒng)歸為p120ctn異常表達(dá)。 3、間接免疫熒光檢測 固定后的冰凍組織切片和細(xì)胞爬片用0.2％ Triton X—100處理15分鐘，非免疫動物血清封閉，一抗為單克隆抗體小鼠抗人Kaiso和小鼠抗人p120ctn4℃孵育過夜；二抗為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記或羅丹明標(biāo)記(TRITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，碘化丙啶或

7、DAPI進(jìn)行核復(fù)染。50％緩沖甘油封片，熒光顯微鏡OlympusⅨ51于波長為527nm處觀察羅丹明熒光強(qiáng)度，于372nm波長處觀察DAPI的熒光染色觀察并照相。陰性對照實驗：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗。 4. Western Blot 將含80μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，單克隆抗體Kaiso或p120ctn4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育2小時后DAB

8、或ECL顯色。 5、RT-PCR 采用TrizolTM試劑提取肺癌組織或培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，利用RNA PCR Kit(AMV) Ver．3.0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。分別擴(kuò)增Kaiso、p120ctn和matrilysin，以β—actin為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，成像分析。 6、細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃，含5％ CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人類肺癌細(xì)胞系BE1、SPC—A—1、LTEP—A—2和A549

9、細(xì)胞系，培養(yǎng)基分別為含10％滅活胎牛血清的RPMI1640或高糖DMEM，貼壁生長，每2—3天胰酶消化傳代一次。 7、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 shRNA干擾質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)宿主細(xì)菌E.coli中擴(kuò)增、純化，使用Arrest—InTMTransfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系LTEP—A—2、SPC—A—1和BE1中，通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效果。 將含有目的基因的

10、載體導(dǎo)入感受態(tài)宿主細(xì)菌DH5α中擴(kuò)增、純化，測序驗證后，使用Lipofect2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，并以G418篩選出陽性細(xì)胞克隆，通過Western Blot和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效果后，挑取轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞在含有G418的RPMI1640或高糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。 8、體外基質(zhì)膠侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 按照BD公司說明操作，取100μl細(xì)胞懸液(5×106個/ml)滴入上室內(nèi)

11、，下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開，將小室置37℃，5％CO2條件下放置后，棄去上室內(nèi)液體，擦盡膜上Matrigel膠，100％甲醇固定30分鐘，常規(guī)蘇木素染色，光鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)。 9、四甲基偶氮唑鹽(tetrazolium，MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度3×105個/ml)分別接種于4個96孔板培養(yǎng)板，每板分6組：空白組

12、(A)(B)，干擾對照組(C)、干擾組(D)、抗體抑制對照組(E)和抗體移植組(F)。培養(yǎng)第24、48、72小時分別加入MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)孵育4小時后，每孔加入150μlDMSO溶解結(jié)晶，選擇波長490nm，在酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實驗重復(fù)3次。繪制細(xì)胞生長曲線。 10、核漿蛋白分離 按照Thermo公司說明操作，取一定體積(100mg)的組織或者10× l06的細(xì)胞，依次加入體

13、積比為200：11:100的試劑CERⅠ，CERⅡ和NER，分別提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。檢測α-Tubulin和Lamin B1在兩種細(xì)胞組分中的表達(dá)以驗證核漿蛋白分離效果。 11、免疫共沉淀 提取的蛋白中加入4μg的誘餌蛋白抗體，充分混勻后4℃孵育2小時后加入25μl Protein G Microbeads，混勻后繼續(xù)4℃孵育1小時。按照操作說明步驟，混合液過μ柱，SDS上樣緩沖液沖洗μ柱，收集免疫共沉淀產(chǎn)物。

14、 12、細(xì)胞周期同步化 G0期同步化(血清饑餓法)：指數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞，培養(yǎng)至匯合密度為30％時收集細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，PBS洗2次后鋪板接種，換成無血清的RPMI—1640/DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36小時后用于檢測。 S期同步化(胸苷雙阻斷法)：指數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入胸苷至終濃度2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)18小時。以1000rpm離心5小時，棄上清，用PBS清洗3次，去除胸苷阻滯。將

15、細(xì)胞重新懸浮成細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)液中再加入胸苷，使之終濃度為2mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，換新鮮培養(yǎng)液，1000rpm離心，預(yù)熱Hanks液清洗2次后接種入另一培養(yǎng)瓶內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時后用于檢測。 13、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集對數(shù)生長期細(xì)胞制成1×107個/ml細(xì)胞懸液。取1ml細(xì)胞懸液75％冷乙醇于4℃固定、離心后制成500μl的細(xì)胞懸液，加碘化丙啶

16、染液于4℃孵育45分鐘后上機(jī)檢測，ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。 14、統(tǒng)計分析 各組資料利用SPSS for Window13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、Kaiso在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的生物學(xué)作用不同。 肺癌組織中Kaiso的表達(dá)量明顯高于癌旁肺組織，Kaiso的漿陽性表達(dá)與肺癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)，可能是影響肺癌不良預(yù)后的獨立危險因素。Ka

17、iso在細(xì)胞核內(nèi)抑制著matrilysin基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Kaiso的核表達(dá)使肺癌的增殖和侵襲能力顯著上調(diào)。 2、p120ctn和Kaiso在肺癌中協(xié)同表達(dá)，p120ctn調(diào)控著Kaiso的蛋白表達(dá)量和核漿分布。 P120ctn與Kaiso在肺癌組織中協(xié)同漿表達(dá)，在肺癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中均能檢測到Kaiso-P120ctn復(fù)合物。P120ctn亞型1和亞型3都可以影響Kaiso的蛋白表達(dá)量，但不影響Kaiso的轉(zhuǎn)錄