ET-1干擾后對肺癌的凋亡、侵襲、增殖的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，威脅著全世界人民生命和健康。同時，它也是世界上發(fā)病率和死亡率增長最快的疾病之一，而且大多數(shù)肺癌患者到晚期才被診斷。在現(xiàn)階段肺癌的治療中，它仍然是無法治愈的。Endothelin(ET)由內(nèi)皮細胞合成，是一種生物活性肽，是一種強烈的血管收縮劑，具有很強的收縮血管作用，隨著對內(nèi)皮素研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素與腫瘤關系密切，對腫瘤細胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡及化學耐藥等方面都有影響。ET能夠產(chǎn)

2、生細胞生長因子，可以促進腫瘤DNA合成，基因表達和腫瘤細胞增殖。ET有21種氨基酸組成。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素家族有四個同分異構(gòu)體亞型包括ET-1 ET-2 ET-3和ET-4。目前的研究中，大部分的研究集中在ET-1。ET-1能夠通過直接或間接旁分泌的方式促進腫瘤血管生成。ET-1蛋白水平在部分惡性腫瘤中是升高的，如膀胱癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌，包括肺癌。研究表明，ET-1在肺癌中高度表達并且參與了肺癌細胞增殖。但是，內(nèi)皮素與腫瘤的

3、生長和轉(zhuǎn)移之間的關系尚未完全闡明。我們通過研究ET-1干擾對肺癌的影響來了解ET-1與肺癌的增殖、侵襲、凋亡關系，從而為ET-1作為肺癌治療靶點提供依據(jù)，并且通過目前廣泛應用于臨床的抗腫瘤藥物恩度觀察兩者是否具有協(xié)同作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建含有干擾ET-1質(zhì)粒(設計3個不同的質(zhì)粒編號538、297、321)的載體，通過熒光定量PCR方法從中篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒載體（編號321），并將干擾效率最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549

4、細胞株，檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　2.ET-1干擾后細胞增殖侵襲凋亡能力的檢測:設立ET-1正常表達組，ET-1干擾組，空載組，恩度組，ET-1干擾聯(lián)合恩度組，空載+恩度組5個實驗組。利用CCK-8檢測細胞增殖變化;流式細胞儀檢測細胞的凋亡細胞周期情況;Transwell檢測侵襲能力。
　　3.WB檢測RhoA/C，VEGF, PEDF, AKT, E-cadherin，and Cox-2相關增殖、侵襲、凋亡相關蛋白的變化。

5、>　　4.ET-1干擾后穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組，注射裸鼠皮下。12只裸鼠隨機分為兩組，對照組和實驗組。對照組接種A549 sh-NC細胞;實驗組接種A549 sh-ET-1細胞。待成瘤后游標卡尺測量瘤子大小;待瘤子長大后將裸鼠處死，取出瘤子進行稱重。
　　結(jié)果:
　　1.ET-1 siRNA對A549細胞增殖的影響通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 siRNA能有效抑制A549細胞增殖。此外，通過Endostar與ET-1 siRNA聯(lián)合組的影響比

6、單獨使用Endostar或ET-1 siRNA組對增殖的影響都要明顯。
　　2.ET-1 siRNA對A549細胞侵襲能力檢測通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 SiRNA可以顯著降低腫瘤細胞的侵襲力。ET-1 SiRNA與Endostar聯(lián)合組抑制腫瘤侵襲力的效果與其他組相比更明顯。
　　3.ET-1 siRNA對A549細胞凋亡能力檢測通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 SiRNA可以顯著增加腫瘤細胞的凋亡，ET-1 siRNA與Endosta

7、r二者對增加腫瘤細胞凋亡效應有協(xié)同作用。
　　4.ET-1 siRNA對A549細胞周期的影響通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 siRNA能有效抑制A549細胞增殖。此外，通過Endostar與ET-1 siRNA聯(lián)合組的影響比單獨使用Endostar或ET-1siRNA組對增殖的影響都要明顯。
　　5.ET-1 siRNA通過WB檢測了RhoA/C，VEGF, PEDF, AKT, E-cadherin，andCox-2等相關蛋白的

8、變化通過研究發(fā)現(xiàn)，在ET-1 SiRNA能明顯降低肺癌細胞侵襲、增殖能力，增加肺癌細胞的凋亡能力。 ET-1 siRNA與Endostar二者對抑制肺癌細胞的侵襲、增殖，增加肺癌細胞的凋亡能力有協(xié)同作用。
　　6.ET-1 SiRNA裸鼠體內(nèi)成瘤測量瘤體腫瘤體積重量我們發(fā)現(xiàn)ET-1 SiRNA在體內(nèi)能有效抑制腫瘤生長。
　　結(jié)論:
　　1.高表達的ET-1肺癌細胞株A549，通過抑制ET-1表達后我們發(fā)現(xiàn)能抑制肺癌細胞