斑馬魚毒-效聯(lián)合評價法在抗骨質(zhì)疏松中藥研究中的應(yīng)用.pdf

1、本研究在課題組前期成功建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步聯(lián)合斑馬魚毒性模型，即成斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法，并將其用于骨碎補(bǔ)配伍代表壯骨藥如淫羊藿、續(xù)斷和代表活血藥如丹參、三七的安全性和壯骨活性，以期為兼顧有效性與安全性的抗骨質(zhì)疏松中藥高效評價提供思路與方法。此外，本研究應(yīng)用斑馬魚模型高效追蹤壯骨關(guān)節(jié)丸的抗骨質(zhì)疏松活性藥味。
　　1.用斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法研究骨碎補(bǔ)配伍壯骨或活血中藥的規(guī)律
　　(1)斑馬魚毒性模型評價藥味

2、/組分配伍前后的安全性
　　斑馬魚毒性模型主要觀察給藥后3天的斑馬魚魚體形態(tài)和顯微檢視結(jié)果，并記錄給藥后每天的胚胎死亡數(shù)目，計算給藥后6天的藥物對斑馬魚胚胎的半數(shù)致死濃度(LC50)。斑馬魚毒性模型成功評價了代表壯骨類中藥骨碎補(bǔ)、淫羊藿、續(xù)斷和代表活血類中藥丹參、三七及其有效組分的毒性大小，并比較了骨碎補(bǔ)與淫羊藿、骨碎補(bǔ)與丹參、淫羊藿與丹參不同配伍比例的安全性大小。
　　單味藥提取物安全性大小順序（以LC50值比較）為:骨碎

3、補(bǔ)50％醇提物（6826μg/mL）＞淫羊藿70％醇提物(1275.25μg/mL)＞丹參水提物(875.43μg/mL)＞三七水提物(135.86μg/mL)＞續(xù)斷水提物(14.227μg/mL)。
　　單味藥的組分安全性大小順序?yàn)?骨碎補(bǔ)總黃酮(545.4μg/mL)＞丹參總酚酸提取物(37.3μg/mL)＞淫羊藿總黃酮(35μg/mL)＞三七總皂苷(12μg/mL)＞丹參酮提取物(5.3μg/mL)＞續(xù)斷總皂苷(1.6μg/

4、mL)。
　　選取毒性較小的藥味依照臨床用量比例進(jìn)行配伍，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)50％醇提物與淫羊藿70％醇提物及骨碎補(bǔ)50％醇提物與丹參水提物配伍過程中，隨著骨碎補(bǔ)50％醇提物在配伍中的含量增多，其安全性隨之增高，但當(dāng)其含量達(dá)到一定比例時，安全性最高，繼續(xù)增加其比例，安全性反而降低。
　　毒性較小的藥味有效成分配伍，骨碎補(bǔ)總黃酮與淫羊藿總黃酮及骨碎補(bǔ)總黃酮與丹參總酚酸提取物配伍，結(jié)果表明有效組分配伍同樣使骨碎補(bǔ)總黃酮的LC50值降低，

5、毒性增強(qiáng)。
　　(2)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型評價藥味/組分配伍前后的有效性
　　選取毒性較小的藥物進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性研究的配伍，按照前期課題組斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的步驟，以斑馬魚頭骨茜素紅染色面積和累計光密度為指標(biāo)，通過顯微檢視圖像計算各藥物配伍前后抗骨質(zhì)疏松活性的起效濃度。
　　斑馬魚骨質(zhì)疏松模型同樣成功評價了上述各藥物及有效組分的抗骨質(zhì)疏松活性，并篩選了骨碎補(bǔ)50％醇提物與淫羊藿70％醇提物生藥比為4∶4和5∶4的比例配

6、伍活性最好;骨碎補(bǔ)50％醇提物與丹參水提物生藥比為1∶1時配伍起效劑量最低;淫羊藿50％醇提物與丹參水提物生藥比為2∶1和3∶1時配伍效果較優(yōu)。在有效組分配伍中，壯骨類成分淫羊藿總黃酮和活血類成分丹參總酚酸提取物與骨碎補(bǔ)總黃酮配伍能夠降低骨碎補(bǔ)總黃酮起效的濃度，減少骨碎補(bǔ)總黃酮用量，起到了協(xié)同增效的功用。
　　2.斑馬魚骨質(zhì)疏松模型篩選壯骨關(guān)節(jié)丸中主要藥味的抗骨質(zhì)疏松活性
　　用斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法篩選壯骨關(guān)節(jié)丸中各藥味的

7、毒性與抗骨質(zhì)疏松活性，依照上述步驟進(jìn)行。各藥味的安全性實(shí)驗(yàn)由課題組其余人員進(jìn)行，本研究主要負(fù)責(zé)主要藥味的藥效活性篩選部分，結(jié)果顯示中成藥壯骨關(guān)節(jié)丸的組成藥味中，補(bǔ)骨脂水提物、淫羊藿水提物、續(xù)斷水提物、骨碎補(bǔ)水提物、狗脊水提物、熟地黃水提物和雞血藤水提物能夠?qū)節(jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松;桑寄生水提物、木香水提物、乳香/沒藥水提物、獨(dú)活水提物不能夠?qū)節(jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松。
　　斑馬魚毒/效聯(lián)合評價法能夠成功實(shí)現(xiàn)中藥及復(fù)方