基于細(xì)胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥藥效學(xué)評價方法的建立.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是危害人類健康的主要疾病之一，尋找切實有效的抗骨質(zhì)疏松藥物已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大課題。傳統(tǒng)中藥里有許多活性物質(zhì)具有抗骨質(zhì)疏松作用，又因其具有副作用小等優(yōu)點，在治療骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著越來越重要的作用。但長期以來，臨床醫(yī)生只是憑經(jīng)驗使用中藥來治療疾病，中藥成分復(fù)雜，即便是臨床上經(jīng)常使用的中藥，也很少有人去研究它們的作用機制。目前中藥現(xiàn)代化的實現(xiàn)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的逐步發(fā)展，使得在更深的層次上研究中藥的藥理作用成為可能。本研究的目的就是

2、建立一種基于細(xì)胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥藥效學(xué)的評價方法。 首先，建立成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。通過酶消化法獲得新生大鼠的成骨細(xì)胞。通過堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定成骨細(xì)胞；用1,25(OH)2D3誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞獲得破骨細(xì)胞，并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色進行鑒定。最后應(yīng)用激光共聚焦顯微技術(shù)，BodipyFLPhallacidin熒光抗體和碘化丙啶(PI)進行標(biāo)記后，觀察兩種細(xì)胞的細(xì)胞骨架F-actin。

3、然后本文采用傳統(tǒng)血清藥理學(xué)的方法制備含藥血清，并對這一方法進行了改進。傳統(tǒng)的方法是對成年大鼠直接灌胃給藥，一段時間后取血制備含藥血清。我們知道，骨質(zhì)疏松癥有很大一部分發(fā)生在絕經(jīng)后的女性，雌激素的下降對骨質(zhì)疏松癥有著明顯的作用。而本文在灌胃前將雌性SD大鼠進行去勢處理，消除血清中雌激素的影響，從而更好的研究血清中的藥物成分對細(xì)胞功能的影響。 再次，我們用體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，建立了抗骨質(zhì)疏松中藥作用于骨形成的藥效學(xué)評價方法。通過WS

4、T-1檢測細(xì)胞代謝情況與增殖活力，用酶標(biāo)儀檢測成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶和胰島素樣生長因子的功能。最后加入龜鹿復(fù)方不同劑量組10％含藥血清，觀察其對成骨細(xì)胞各項功能指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組血清可明顯促進成骨細(xì)胞增殖、ALP活性和IGF-1的分泌，說明龜鹿復(fù)方可以促進成骨細(xì)胞的骨形成。 最后，我們用體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞，建立抗骨質(zhì)疏松中藥作用于骨吸收的藥效學(xué)評價方法。我們用掃描電鏡(ScanningMicroscope)技術(shù)觀察破

5、骨細(xì)胞形成的骨凹陷；同時檢測TRAP(+)細(xì)胞數(shù)和破骨細(xì)胞TRAP活性。最后加入龜鹿復(fù)方含藥血清進行干預(yù)，方法同成骨細(xì)胞。結(jié)果表明，中劑量組血清可明顯抑制骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制骨凹陷形成，降低細(xì)胞內(nèi)TRAP的活性，減少TRAP(+)細(xì)胞數(shù)。說明龜鹿復(fù)方可以抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。 綜上所述，本文建立了基于細(xì)胞水平的抗骨質(zhì)疏松中藥的藥效學(xué)評價方法，并加入中藥龜鹿復(fù)方進行驗證。發(fā)現(xiàn)龜鹿復(fù)方的抗骨質(zhì)疏松作用機制可能跟以下2個方