雙參合劑對(duì)醋酸潑尼松致大鼠骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)研究及其質(zhì)量控制研究.pdf

1、目的：
　　 臨床上長期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(GC)可導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,防治主要采用治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的藥物。本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研制的雙參合劑對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的類似老年性骨質(zhì)疏松有效,但是否可用于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松還沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用醋酸潑尼松建立大鼠骨丟失模型,通過觀察大鼠的骨成分、血清骨代謝酶、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、骨密度,骨生物力學(xué)等指標(biāo)的影響,評(píng)價(jià)雙參合劑對(duì)醋酸潑尼松致大鼠骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用,為該制劑開發(fā)為抗骨質(zhì)疏松新

2、藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,隨機(jī)分成5組,每組8只,對(duì)照組(CON)每日給予蒸餾水5ml/kg灌胃;激素組(GC)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/kg灌胃;激素邯可侖膦酸鈉(GC+AST)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/kg以及阿侖膦酸鈉0.9mg/kg灌胃;激素+低劑量雙參合劑組(GC+SSL)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/kg以及29％雙參口合劑

3、5ml/kg灌胃;激素+高劑量雙參合劑組(GC+SSH)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/kg以及87%雙參口合劑5ml/kg灌胃;以上藥物分為上下午兩次給藥,連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第14天、第13天和第4天、第3天注射鈣黃綠素7mg/kg作骨雙熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),心臟取血處死大鼠,收集血液,離心分離血清,測(cè)定血清骨代謝酶及血清睪酮含量;分離右側(cè)脛骨:右側(cè)脛骨上段制成不脫鈣骨切片、中段骨制成厚片,通過半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)

4、參數(shù)測(cè)量;取右側(cè)尺骨鹽酸消化后ICP等離子體發(fā)射光譜法測(cè)骨鈣、磷,羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)骨羥脯氨酸含量,取右股骨測(cè)量其骨物理指標(biāo)、骨密度(DEXA法)及骨生物力學(xué)參數(shù)(股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)),以此評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠骨成分、骨量、骨質(zhì)量等變化;另外稱取腎臟、脾臟等濕重計(jì)算臟器指數(shù)等以觀察相關(guān)臟器大體變化。
　　 2.雙參合劑的制備及含量測(cè)定:取丹參藥材3.6kg,人參須藥材5kg,粉碎,加水提兩次,濃縮成生藥量29%雙參合劑,用高效液相色譜法,

5、分別檢測(cè)雙參合劑中人參皂苷Re和丹參素的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.糖皮質(zhì)激素致大鼠骨質(zhì)疏松癥的特點(diǎn)(1)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)①脛骨上段松質(zhì)骨有明顯的骨丟失:與正常對(duì)照組比較,糖皮質(zhì)激素大鼠脛骨上段松質(zhì)骨的骨小梁面積百分率(%Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁數(shù)量(Tb.N)分別降低了24.0%、20.5%和5.9%,骨小梁分離度(Tb.Sp)增加了30.0%,但由于組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差大,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義;熒光周長百分?jǐn)?shù)(%L.Pm)增加了8.2%;骨礦化沉積率(MAR)、骨形成率(BFR/BS)分別降低了14.3%、9.7%,破骨細(xì)胞數(shù)量(Oc.No)和每毫米破骨細(xì)胞數(shù)(Oc.N/mm)分別顯著增加153.6%和227.3%(P＜0.01)。結(jié)果提示脛骨上段松質(zhì)骨骨丟失與骨吸收增強(qiáng)有關(guān)。②脛骨中段皮質(zhì)骨存在骨丟失:與正常對(duì)照組比較,糖皮質(zhì)激素大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的皮質(zhì)面積百分?jǐn)?shù)(%Ct.Ar)下降1.8%,骨髓面積百分?jǐn)?shù)(%Ma.Ar

7、)增加6.7%,骨外膜的熒光百分?jǐn)?shù)(%P-L.Pm)、骨礦化沉積率(MAR)和骨形成率(BFR/BS)分別降低42.0%、33.6%和59.5%,骨內(nèi)膜的熒光百分?jǐn)?shù)(%E-L.Pm)、骨礦化沉積率(MAR)和骨形成率(BFR/BS)分別降低34.0%、34.5%和53.6%。結(jié)果提示脛骨中段皮質(zhì)骨存在骨丟失。
　　 (2)骨鈣與骨羥脯氨酸明顯減少與正常對(duì)照比較,糖皮質(zhì)激素大鼠股骨鈣(Ca)、骨磷(P)、羥脯氨酸(Hyp)減少(P

8、＜0.05或P＜0.01)。說明骨丟失涉及有機(jī)質(zhì)與無機(jī)質(zhì)兩方面。
　　 (3)股骨骨密度明顯減少股骨全段及股骨遠(yuǎn)端1cm BMD均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (4)股骨骨生物力學(xué)性能明顯減弱,骨折風(fēng)險(xiǎn)增加股骨的最大載荷、彈性載荷、彎曲能量、剛性系數(shù)明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)(5)其他觀察指標(biāo)特點(diǎn)體重、胸腺、脾臟(P＜0.05)和腓腸肌濕重減輕,腎臟指數(shù)增加,血清堿性磷酸酶活力、血清睪酮含量

9、降低(P＜0.05)。
　　 2.阿侖膦酸鈉對(duì)糖皮質(zhì)激素致大鼠骨質(zhì)疏松的影響與糖皮質(zhì)激素組比較,阿侖膦酸鈉組尺骨Ca/P增加(P＜0.01);股骨骨密度增加,股骨全段及股骨遠(yuǎn)端1cm BMD均增加(P＜0.05);阿侖膦酸鈉使糖皮質(zhì)激素大鼠體重增加,血清堿性磷酸酶活力增加(P＜0.05),睪酮含量升高(P＜0.05);在骨形態(tài)計(jì)量學(xué)方面,脛骨上段松質(zhì)骨破骨細(xì)胞數(shù)量和每毫米破骨細(xì)胞數(shù)較激素組顯著降低50.7%和66.7%(P＜0.

10、01),基本達(dá)對(duì)照組水平。
　　 3.雙參合劑對(duì)糖皮質(zhì)激素大鼠骨質(zhì)疏松的影響(1)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)提示雙參合劑可預(yù)防糖皮質(zhì)激素大鼠骨質(zhì)疏松①脛骨上段松質(zhì)骨:與糖皮質(zhì)激素組比較,雙參合劑低劑量組的%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N分別增加31.7%、3.3%、32.9%,rb.Sp、Oc.No和Oc.N,/mill分別降低了39.3%、60.0%和75.0%;雙參合劑高劑量組%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N分別增加35.7%、13.

11、6%和22.4%,Tb.Sp、Oc.No和Oc.N/mm分別降低了33.6%、58.6%和75.0%:以上各項(xiàng)目恢復(fù)甚至超越正常對(duì)照組(P＜0.05&P＜0.01)。雙參合劑低劑量組%L.Pm降低2.4%、MAR、BFR/BS分別增加31.4%、34.5%,雙參合劑高劑量組%L.Pm降低14.9%、MAR.、BFRfBS分別增加20.9%、4.2%。雙參合劑可部分預(yù)防糖皮質(zhì)激素大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨丟失,與其抑制骨吸收,增長骨形成有關(guān)。<

12、br>　　 ②脛骨中段皮質(zhì)骨:與糖皮質(zhì)激素組比較,雙參合劑高、低劑量組%P-L.Pm分別增加73.6%、74.9%(P＜0.05)。雙參合劑低劑量對(duì)糖皮質(zhì)激素大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨丟失有較好預(yù)防作用。
　　 (2)骨鈣、骨磷及骨羥脯氨酸增加與糖皮質(zhì)激素組比較,雙參合劑高、低劑量能同時(shí)增加股骨Ca、骨P及Hyp含量(P＜0.01)。
　　 (3)股骨骨密度增加雙參合劑低劑量使股骨全段、股骨遠(yuǎn)端1cm及股骨近端2cm BMD均

13、明顯增加(P＜0.01&P＜0.05)。
　　 (4)股骨生物力學(xué)性能恢復(fù)雙參合劑高劑量使股骨最大載荷和彈性載荷、剛性系數(shù)等指標(biāo)均有所恢復(fù)(P＜0.01&P＜0.05)。
　　 (5)雙參合劑增加糖皮質(zhì)激素大鼠體重,使胸腺、脾臟、腎臟及心臟重恢復(fù)(P＜0.01&P＜0.05),血清堿性磷酸酶活力增加(P＜0.01)。
　　 4.雙參合劑中人參皂苷Re及丹參素含量人參皂苷Re在0.04～0.5gg(r=1),丹參素

14、在0.348～4.351.tg(r=1)范圍內(nèi)含量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率分別為105.01%、101.90%。雙參合劑中人參皂苷Re平均含量104.26μg/ml,丹參素平均含量378.11μg/ml。
　　 結(jié)論：
　　 1.3月齡的SD大鼠給予糖皮質(zhì)激素12周后,出現(xiàn)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松,其中,皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量均丟失,同時(shí)骨鈣、骨磷與骨羥脯氨酸成分減少,骨生物力學(xué)性能減弱、骨密度減少,出現(xiàn)體重減輕

15、、血清堿性磷酸酶活力下降、血清睪酮含量減少等現(xiàn)象。
　　 2.阿侖膦酸鈉0.9mg/kg灌胃給藥12周可使糖皮質(zhì)激素大鼠破骨細(xì)胞數(shù)降低,骨Ca/P升高,骨密度明顯恢復(fù),可抑制糖皮質(zhì)激素大鼠所致的體重減少、血清堿性磷酸酶活力下降和血清睪酮含量減少。
　　 3.29%(低劑量)和87%(高劑量)的雙參合劑灌胃給藥12周后均有效防治糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松癥,雙參合劑可通過抑制骨吸收,增加骨形成,減少骨的丟失,從而增加松質(zhì)骨、皮質(zhì)

16、骨的骨量,雙參合劑還可改善骨微觀結(jié)構(gòu),增加骨鈣、骨磷與骨羥脯氨酸的含量,增加骨密度,修復(fù)骨生物力學(xué)性能,保持骨質(zhì)量,從而降低骨折發(fā)生的危險(xiǎn)性;雙參合劑增加糖皮質(zhì)激素大鼠體重,使胸腺、脾臟、腎臟及心臟重恢復(fù),增加血清堿性磷酸酶活力。但高、低劑量雙參合劑效果并不呈量效關(guān)系變化。雙參合劑比阿侖膦酸鈉在防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松方面效果更顯著。
　　 4.人參皂苷Re和丹參素在所選用測(cè)定條件下能夠得到較好地分離,檢測(cè)靈敏度高,測(cè)定專屬性強(qiáng)