哮喘大鼠氣道平滑肌肌漿網(wǎng)鈣泵和磷酸受納蛋白的表達及藥物的干預作用.pdf

1、支氣管哮喘(Asthma或Bronchial Asthma)是一種以氣流可逆性阻塞、氣道慢性炎癥、氣道高反應性為特征的復雜的炎癥性疾病,是嚴重影響人們健康的常見病、多發(fā)病.哮喘發(fā)病機制十分復雜,但不管何種機制,所引起的支氣管哮喘的發(fā)生都是和氣道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)的結構和功能異常是分不開的.鈣是引起平滑肌收縮的關鍵物質(zhì),胞漿游離鈣濃度([Ca<'2+>]i)下降會產(chǎn)生平滑肌絲的松弛.在氣道平滑肌中,

2、肌漿網(wǎng)Ca<'2+>-ATP酶(SERCA)將胞漿內(nèi)鈣離子攝入肌漿網(wǎng)內(nèi),是[Ca<'2+>]i下降的主要途徑.氣道平滑肌主要表達SERCA2b同工型鈣泵.SERCA2b活性大部分則由磷酸受納蛋白(Plaospholambam,PLB)調(diào)節(jié).國內(nèi)外均有研究顯示,SERCA和PLB基因及蛋白表達的改變導致心肌細胞收縮功能受損,而應用β受體阻滯劑能增加受損心肌SERCA基因及蛋白的表達,同時減少PLB基因和蛋白的表達,從而部分恢復心肌細胞的正

3、常收縮功能.那么,在哮喘的發(fā)病過程中,氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達的改變是否也發(fā)揮了一定的作用?哮喘治療藥物長效β2受體激動劑和吸入用糖皮質(zhì)激素治療哮喘機制是否有氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達的改變參與其內(nèi)?這些問題尚需實驗進一步探討. 目的:采用主動致敏后重復抗原攻擊的大鼠為哮喘模型,觀察氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達的改變.并且在動物模型上應用選擇性SERCA抑制劑環(huán)匹阿尼酸,觀察其療效

4、,以確定其在哮喘發(fā)病機制中的作用.應用長效β<,2>受體激動劑和吸入用糖皮質(zhì)激素,觀察療效,探討它們治療哮喘機制是否有SERCA和PLB基因及蛋白表達的改變參與其內(nèi). 方法:將清潔級健康雄性SD大鼠48只,隨機分為六組,每組8只,即福莫特羅組、布地奈德組、福莫特羅+布地奈德組、環(huán)匹阿尼酸組、對照組、模型組.通過卵白蛋白致敏及攻擊后建立大鼠哮喘模型,并在每次攻擊前,相應將各組用藥霧化吸入.最后一次霧化24小時后,進行肺功能測定,并

5、計算肺阻力,肺動態(tài)順應性.大鼠放血處死后,進行肺泡灌洗,計數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞比例,取肺組織進行病理切片以觀察肺組織炎癥情況.分離氣管平滑肌用TRIZOL提取總RNA,RT-PCR法半定量測定支氣管平滑肌中SERCA和PLB mRNA的表達水平;用蛋白裂解液提取總蛋白,用Westernblot法半定量測定支氣管平滑肌中SERCA和PLB蛋白的表達水平. 結果: 1.大鼠哮喘模型建立:模型組大

6、鼠經(jīng)抗原攻擊后測肺功能,肺阻力較對照組明顯升高(P<0.01),肺動態(tài)順應性則顯著下降(P<0.01);氣道內(nèi)出現(xiàn)了以嗜酸性粒細胞(Eos)浸潤為主的炎癥反應,表現(xiàn)為BALF中Eos計數(shù)較對照組明顯升高(P<0.01);病理切片也發(fā)現(xiàn)平滑肌增生肥厚,間質(zhì)嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤明顯增多.以上均為大鼠哮喘模型的基本特征,提示哮喘模型建立成功. 2.藥物治療影響:①哮喘大鼠經(jīng)福莫特羅、布地奈德治療后,與模型組相比,肺動態(tài)順應性均明

7、顯上升(P<0.01),肺阻力也都有顯著下降(P<0.01),兩藥聯(lián)用組雖然也有明顯的肺功能改善(P<0.01),但較單一用藥效果差異不顯著.環(huán)匹阿尼酸治療組肺功能則無明顯緩解.BALF計數(shù)結果顯示布地奈德組(P<0.05)和聯(lián)合治療組(P<0.01)的BALF細胞總數(shù)明顯較模型組減少;嗜酸性粒細胞總數(shù)福莫特羅組(P<0.01)、布地奈德組(P<0.01)、福莫特羅+布地奈德組(P<0.01)、環(huán)匹阿尼酸組(P<0.05)均比模型組有明

8、顯下降.以上結果提示福莫特羅,布地奈德治療有效.②SERCA和PLB基因和蛋白的表達水平:模型組的SERCA基因和蛋白表達水平較對照組均有明顯上調(diào)(P<0.01);和模型組相比,布地奈德組、聯(lián)合治療組和環(huán)匹阿尼酸組的SERCAmRNA水平有明顯的下降(P<0.05),SERCA蛋白水平也有下降,但統(tǒng)計無明顯差異;而福莫特羅組則無明顯改變.模型組的PLB基因和蛋白表達水平也較對照組有明顯上升(P<0.01):布地奈德組和聯(lián)合治療組的PLB

9、基因和蛋白表達水平較模型組有顯著下調(diào)(P<0.05);而福莫特羅和環(huán)匹阿尼酸組的PLB基因和蛋白表達水平雖然有下降,但沒有統(tǒng)計學差異. 結論:1.大鼠哮喘模型中SERCA、PLB基因和蛋白表達明顯增加,提示SERCA和PLB基因和蛋白表達改變參與了哮喘發(fā)病機制.2.長效β 2受體激動劑福莫特羅對大鼠氣道平滑肌SERCA、PLB基因和蛋白表達無明顯作用.3.吸入型糖皮質(zhì)激素布地奈德對大鼠氣道平滑肌SERCA、PLB基因表達有明顯的