PFP和GzmB在哮喘大鼠肺組織中的表達(dá)及rhGH的干預(yù)作用.pdf

1、支氣管哮喘是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共健康最常見(jiàn)的慢性肺部疾病之一,主要以反復(fù)發(fā)作性的氣急、胸悶、咳嗽等為主要臨床癥狀,常在夜間和(或)清晨發(fā)作,如果長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作則可致氣道重塑導(dǎo)致氣道增厚與狹窄,最終成為阻塞性肺氣腫。目前尚未完全明確哮喘的具體發(fā)病機(jī)制,有研究表明支氣管上皮細(xì)胞的脫落和損傷參與了哮喘的病理過(guò)程,支氣管上皮細(xì)胞的凋亡為哮喘發(fā)病的起始環(huán)節(jié)。穿孔素(PFP)和顆粒酶B(GzmB)主要由細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞(NK

2、細(xì)胞)分泌,是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子,其在哮喘大鼠肺組織中的表達(dá)高低以及其對(duì)支氣管上皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用目前尚不明確。重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)為人工合成的一種多肽,其能夠通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制抑制相應(yīng)細(xì)胞的凋亡從而達(dá)到治療目的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠哮喘模型并應(yīng)用rhGH進(jìn)行干預(yù),觀察PFP與GzmB的在肺組織中的表達(dá)情況、上皮細(xì)胞凋亡變化及其相互關(guān)系,以期為臨床治療哮喘提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立哮喘大鼠模型,探討哮

3、喘大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡情況、肺組織中PFP、GzmB的表達(dá)情況及rhGH的干預(yù)作用。
　　 材料和方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和哮喘模型制作選取健康雄性4-6周齡SD大鼠30只,遵照隨機(jī)原則分為正常對(duì)照組、哮喘模型組和rhGH干預(yù)組,每組各10只。第1,8,15天哮喘組和干預(yù)組大鼠分別應(yīng)用新鮮調(diào)配的10％卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液1ml(其中卵清蛋白100mg,氫氧化鋁100mg)腹腔注射,致敏3次,對(duì)照組大鼠應(yīng)用生理

4、鹽水1ml進(jìn)行腹腔注射。第16d開(kāi)始,分別應(yīng)用1％卵清蛋白-氫氧化鋁混懸液5ml給哮喘組和干預(yù)組大鼠霧化吸入30分鐘,隔日進(jìn)行1次共霧化20次；干預(yù)組各大鼠在第11次霧化吸入混懸液前30分鐘給予皮下注射rhGH(1.33KU／Kg),共注射10次；對(duì)照組大鼠每次霧化吸入生理鹽水5ml30分鐘,隔日1次,共進(jìn)行20次。
　　 2.肺組織標(biāo)本制備最后一次霧化吸入后各組大鼠分別腹腔注射苯巴比妥100mg處死,迅速解剖取右肺置于冷凍管中

5、并放入液氮灌中凍存,做RT—PCR用。應(yīng)用無(wú)菌生理鹽水和4％甲醛溶液對(duì)左肺進(jìn)行灌注和沖洗,甲醛固定后行石蠟包埋。分別于取垂直和平行氣道兩個(gè)方向取材切片,作HE染色及TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　 3.原位細(xì)胞凋亡結(jié)果分析于光鏡下分析結(jié)果:隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡野(×400并且含有同等級(jí)別支氣管)的支氣管上皮總數(shù)及陽(yáng)性染色上皮細(xì)胞數(shù)(著色為棕黃色),按照公式:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100％以計(jì)算上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)。
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6、.RT-PCR分析將凍存的肺組織采用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.后應(yīng)用事先設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增目的片段PFP、GzmB與GAPDH。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,用Band Scan5.0凝膠分析軟件分別測(cè)定PFP、GzmB與GAPDH的灰度值,并分別以與兩者的比值作為該大鼠的代表值。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,多個(gè)樣本均數(shù)間的比較

7、采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD—t檢驗(yàn):相關(guān)分析采用pearson相關(guān)行檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.病理學(xué)改變
　　 正常對(duì)照組肺組織形態(tài)學(xué)無(wú)異常改變。哮喘模型組大鼠肺組織HE染色后可見(jiàn)支氣管管腔中有大小不一的粘液栓形成,支氣管上皮細(xì)胞水腫、脫落、結(jié)構(gòu)不規(guī)則；杯狀細(xì)胞增多,黏膜下層及平滑肌增厚；氣道壁及肺間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主；rhGH干預(yù)

8、組炎癥反應(yīng)較哮喘組輕,杯狀細(xì)胞減少,黏膜下層及平滑肌增厚較哮喘組減輕。
　　 2.上皮細(xì)胞凋亡的變化正常對(duì)照組支氣管上皮凋亡(TUNEL原位細(xì)胞凋亡染色為棕黃色)較少；哮喘組支氣管上皮有較多凋亡,高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用rhGH干預(yù)后支氣管上皮細(xì)胞凋亡高于正常對(duì)照組,但明顯低于哮喘組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR結(jié)果哮喘組和干預(yù)組的PFP及GzmB表達(dá)量均較正常

9、對(duì)照組增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),rhGH干預(yù)組的兩者的表達(dá)量均較哮喘組減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.相關(guān)性分析
　　 哮喘大鼠肺組織中PFP表達(dá)量與支氣管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.800,P<0.05),GzmB表達(dá)量與支氣管上皮凋亡指數(shù)亦呈正相關(guān)(r=0.806,P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)PFP及GzmB通過(guò)促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞的凋亡參與了