SDF-1及CXCR4在哮喘小鼠肺組織中的表達及布地奈德的干預作用.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細胞,包括炎性細胞和氣道結構細胞以及細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病,以氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應性為特點。反復的氣道炎癥在不斷的損傷與修復過程中,逐漸引起了氣道結構的改變,包括上皮細胞脫落、上皮下纖維化、氣道平滑肌增厚、平滑肌層與上皮層距離縮短、黏液腺化生和杯狀細胞化生、血管增生及重塑、氣道壁水腫等,被稱為氣道重塑。氣道重塑與哮喘患者的氣道高反應性及不完全可逆性氣流受限都有著密切的關系,其具體發(fā)生機制尚未完全

2、闡明?；|(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cellderived factor-1,SDF-1)及CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor4,CXCR4)屬于趨化因子家族,兩者相互作用通過趨化炎癥細胞、促進血管生成和血管重塑、調(diào)節(jié)其他細胞因子的表達等影響支氣管哮喘的病理生理過程及氣道重塑的發(fā)生。本實驗通過建立小鼠哮喘模型,研究SDF-1及CXCR4在小鼠肺內(nèi)的表達以及二者在哮喘氣道重塑發(fā)生中的作用,并應用布地

3、奈德進行干預,以期為哮喘的早期干預及治療提供理論依據(jù)。
　　 目的
　　 本實驗通過建立小鼠哮喘模型,探討哮喘小鼠發(fā)病過程中基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)及其受體CXCR4在肺內(nèi)表達的變化,及布地奈德的干預對其表達的影響。
　　 材料和方法：
　　 1動物分組和模型制作方法
　　 雄性清潔級6-8周齡BALB/c小鼠30只,隨機分為對照組、哮喘組、干預組,每組10只。哮喘組小鼠于第1天、第8天和第

4、15天腹腔注射卵清蛋白(ovalbumin,OVA)/氫氧化鋁混合液0.2ml(內(nèi)含OVA20μg,氫氧化鋁1 mg)致敏,從第22天開始用2％OVA生理鹽水霧化吸入激發(fā),隔天一次,每次30分鐘,共激發(fā)7次；干預組以相同方法致敏和激發(fā),每次OVA霧化激發(fā)30分鐘前用1mg布地奈德混懸液霧化治療；對照組腹腔注射及霧化吸入均用生理鹽水替代,方法同哮喘組。
　　 2肺組織標本處理
　　 各組小鼠于末次霧化結束后24小時內(nèi)用戊巴

5、比妥鈉45mg/kg腹腔注射進行麻醉,迅速開胸取左肺,置于液氮凍存,留作RT-PCR用,然后經(jīng)右心室插管至肺動脈,用生理鹽水快速沖沈后取右肺中葉,置于4％甲醛溶液固定24小時,酒精梯度脫水,石蠟包埋,做厚度5μm切片,分別做HE染色和免疫組織化學染色。
　　 3免疫組化及HE染色結果分析
　　 結果：分析采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件,對HE染色圖片測定相同級別的完整的支氣管橫斷面的支氣管壁面積(μm

6、2)、氣道上皮黏膜層面積(μm2)、氣道平滑肌面積(μm2),并將其與基底膜周徑(μm)的比值代表氣道壁厚度(μm2/μm)、上皮黏膜層厚度(μm2/μm)、平滑肌層厚度(μm2/μm)。對于免疫組化圖片測定陽性區(qū)平均光密度值,每張切片選擇至少5個高倍鏡視野,取其平均值作為該切片的代表值。
　　 4 RT-PCR
　　 將凍存左肺用Trizol法提取總RNA,并逆轉錄為cDNA,設計引物擴增目的片段CXCR4與β-act

7、in。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳,用Band Scan5.0凝膠分析軟件分別測定CXCR4與β-actin的灰度值,并以CXCR4與β-actin的比值作為該小鼠的代表值。
　　 5統(tǒng)計學方法
　　 應用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差((x)±s)表示。各組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,各因素之間的相關性采用pearson相關分析,以α=0.05為檢驗水準。
　　

8、 結果：
　　 1病理學改變
　　 哮喘組小鼠氣道壁增厚,管腔變形狹窄,氣道上皮細胞脫落,杯狀細胞化生,黏液分泌增多,平滑肌層明顯增厚,黏膜下及管壁周圍炎性細胞浸潤明顯。干預組上皮細胞偶有脫落,黏膜相對完整,氣道壁增厚及炎癥細胞浸潤均明顯輕于哮喘組。對照組肺組織幾乎無上述病理改變。
　　 2免疫組化結果
　　 SDF-1在哮喘組的表達(0.426±0.052)顯著高于對照組(0.268±0.037),經(jīng)布

9、地奈德干預后小鼠肺內(nèi) SDF-1的表達水平(0.361±0.065)明顯低于哮喘組小鼠,P<0.05。
　　 3 RT-PCR結果
　　 CXCR4哮喘組的表達0.829±0.027)顯著高于對照組(0.607±0.124),經(jīng)布地奈德干預后小鼠肺內(nèi)CXCR4的表達水平(0.723±0.094)明顯低于哮喘組小鼠,P<0.05。
　　 4相關性分析
　　 SDF-1表達量與氣道壁厚度呈正相關(γ=0.74