IL-32、MMP-9及TNF-α在哮喘小鼠氣道內(nèi)的表達及布地奈德的干預(yù)作用.pdf

1、2010年GINA方案中哮喘的定義是:哮喘是由多種細胞和細胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。由于氣道內(nèi)反復(fù)炎癥損傷和反復(fù)修復(fù)的刺激,從而導(dǎo)致氣道重塑的發(fā)生,這一病理變化在哮喘的早期、甚至在確診哮喘前就已經(jīng)出現(xiàn)了。因此我們推測氣道重塑可能在哮喘的整個發(fā)病過程中都發(fā)揮了作用。白細胞介素-32(interleukin-32,IL-32)作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子,很多文獻證明其在炎癥反應(yīng)中有重要作用。2008年Calabrese[1]等

2、研究發(fā)現(xiàn)IL-32在慢性阻塞性肺病(chronic obcsructive pulmonary disease,COPD)患者中高表達,參與了COPD的特殊免疫反應(yīng),由于COPD的發(fā)病機制與支氣管哮喘有許多相似之處,因此我們推測IL-32也可能參與了哮喘的發(fā)病過程。腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinases-9,MMP-9)在哮喘氣道

3、重塑過程中的作用已得到大量研究證實,但IL-32在此過程中的作用及其與兩者之間的相關(guān)性均未見報道。本實驗中通過建立小鼠哮喘模型,研究IL-32、MMP-9和TNF-α(在哮喘小鼠氣道內(nèi)的表達,以及三者在氣道重塑過程中的作用機制,同時霧化吸入布地奈德行干預(yù)治療,旨在為尋求用于哮喘診斷及分類的新的標記物,以及新的治療靶向提供實驗依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過檢測哮喘小鼠氣道內(nèi)IL-32、MMP-9和TNF-α的表達,目的是

4、為了探討三者在哮喘氣道重塑中的作用機制,以及布地奈德對它們在此過程中的干預(yù)作用,旨在為尋求用于哮喘診斷及分類的新的生物標記物,以及新的治療靶向提供實驗依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1實驗動物分組及哮喘模型制作方法
　　 SDF級5-6周齡雌性小鼠30只,隨機分為3組,即哮喘組(A組)、干預(yù)組(B組)和對照組(C組),每組10只。實驗開始第1天、第8天和第15天,哮喘組每只小鼠腹腔注射卵清蛋白(ovalbmin

5、,OVA)/氫氧化鋁混懸液0.2ml行基礎(chǔ)致敏,從第22天開始隔天1次,共7次,,霧化吸入2％OVA氣溶膠進行激發(fā),每次激發(fā)30分鐘;干預(yù)組致敏和激發(fā)的方法與哮喘組相同,不同的是每次激發(fā)30分鐘前,先霧化吸入30分鐘1mg(2ml)布地奈德混懸液干預(yù)治療;對照組用生理鹽水替代OVA,其方法和劑量均與哮喘組相同。
　　 2標本留取過程
　　 各組小鼠于未次霧化結(jié)束后24小時內(nèi),依次用乙醚麻醉,固定,開胸后從右心室插至腫動脈

6、,生理鹽水快速沖洗干凈后,4%的甲醛溶液注入進行內(nèi)固定,待小鼠全身僵硬固定后取左肺上葉,放入4%的甲醛溶液外固定24小時以上,然后酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片,厚度約5um,最后做HE染色和免疫組織化學(xué)染色。
　　 3 HE染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析
　　 用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件對實驗結(jié)果進行分析,從HE染色圖片中挑選出完整的、級別相同的支氣管作為測量對象,分別測量氣道壁厚度(um)和平滑肌

7、層厚度(um),兩者之差即為上皮粘膜層厚(um)。挑選出免疫組化染色清晰的圖片,每張切片選擇5個高倍鏡視野,分別測定IL-32、MMP-9和TNF-α陽性區(qū)的平均光密度值,該切片的代表值即為這5個值的平均值。
　　 4統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均用(-x±s)表示。用單因素方差分析的方法對各組樣本均數(shù)進行比較,用LSD-t檢驗方法進行各組間兩兩比較,用pearson相關(guān)性

8、分析的方法進行各因素之間的相關(guān)性分析,以α=0.05為榆驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 1肺組織病理改變
　　 1.1大體改變哮喘組小鼠肺組織均輕度均勻膨脹,表面有不規(guī)則的暗紅充血區(qū),顏色顯蒼白和渾濁,切面處可見白色分泌物滲出。布地奈德干預(yù)組也有上述改變,但程度輕微。對照組未見上述改變。
　　 1.2病理學(xué)改變哮喘組小鼠肺內(nèi)支氣管粘膜下、支氣管及血管周圍炎性細胞浸潤明顯(包括嗜酸性粒細胞(Eosnophil

9、s,EOS)、中性粒細胞和淋巴細胞等),粘膜下水腫,粘液腺增生,分泌物增多,粘膜皺襞增多,氣道上皮可見多處斷裂和上皮細胞的脫落,細支氣管平滑肌輕度肥大,支氣管壁和基底膜增厚且形狀不規(guī)則。干預(yù)組小鼠肺組織也可出現(xiàn)以上病理變化,但程度較哮喘組明顯減輕。對照組小鼠肺組織未發(fā)現(xiàn)以上病理改變。
　　 2免疫組化結(jié)果
　　 2.1 IL-32在哮喘組的表達(151.888±6.863)顯著高于對照組(100.706±7.410),布

10、地奈德干預(yù)后IL-32的表達水平(121.702±5.421)明顯低于哮喘組的表達,P＜0.05。
　　 2.2 TNF-α在哮喘組的表達(147.657±7.756)顯著高于對照組(114.813±9.809),布地奈德干預(yù)后TNF-α的表達水平(137.326±9.487)明顯低于哮喘組,P＜0.05。
　　 2.3 MMP-9在哮喘組的表達(148.936±9.818)顯著高于對照組(110.689±4.796),

11、布地奈德干預(yù)后MMP-9的表達水平(128.027±10.900)明顯低于哮喘組,P＜0.05。
　　 3相關(guān)性分析
　　 3.1 IL-32與TNF-α在氣道內(nèi)的表達呈正相關(guān)(r=0.835,P＜0.01),與氣道壁厚度呈正相關(guān)(r=0.897,P＜0.01)。
　　 3.2 TNF-α與MMP-9在氣道內(nèi)的表達呈正相關(guān)(r=0.924,P＜0.01),與氣道壁厚度呈正相關(guān)(r=0.907,P＜0.01)。