甘草與芫花合用對(duì)腸粘膜P-糖蛋白及藥物經(jīng)腸粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.pdf

1、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是屬于ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的能量依賴性膜蛋白，分子量為170 kDa，可發(fā)揮外排泵作用，將細(xì)胞內(nèi)的化合物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。P-gp除在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)外，在正常機(jī)體組織和器官如肝臟、腎臟、胎盤、大腦、睪丸及腸刷狀緣膜等部位均有高水平的表達(dá)。存在于腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜中的P-gp能將藥物從漿膜側(cè)泵回至粘膜側(cè)而進(jìn)入腸腔

2、排出，導(dǎo)致藥物透膜吸收減少，血藥濃度降低。因此，受腸粘膜P-gp調(diào)控的經(jīng)腸道吸收藥物可以通過抑制腸粘膜P-gp的活性而增加吸收，提高生物利用度。現(xiàn)已證實(shí)，許多藥物均為腸粘膜P-gp的抑制劑，例如維拉帕米、環(huán)胞菌素A、奎尼丁、一些表面活性劑等。 中藥十八反是中醫(yī)界沿襲數(shù)千年的用藥禁忌。有研究表明，甘草與反藥合用前后對(duì)細(xì)胞色素P450具有不同的調(diào)控作用。令人感興趣的是P-gp的底物特異性很大程度上與細(xì)胞色素P450同工酶（CYP3A

3、1-3）相似，二者有很多重疊的底物，如利福平、利多卡因、地高辛以及環(huán)孢菌素等。那么，這些反藥對(duì)合用前后也有可能對(duì)腸粘膜P-gp產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用，這可能是反藥合用引起臨床上產(chǎn)生毒性的原因。文獻(xiàn)檢索表明，目前國(guó)內(nèi)外尚未見由探討腸粘膜P-gp的表達(dá)同中藥配伍合理性之間的研究報(bào)告，因此探討中藥反藥對(duì)合用后毒性增加是否同P-gp表達(dá)的改變等研究具有較高的學(xué)術(shù)價(jià)值。 本課題選擇十八反藥對(duì)中的甘草與芫花作為模型藥對(duì)進(jìn)行研究。利用體外擴(kuò)散池法

4、（Ussing chamber）和在體In situ實(shí)驗(yàn)，分析甘草芫花合用前后對(duì)腸粘膜P-gp表達(dá)的影響。選擇P-gp典型底物藥物羅丹明123（R123）和旁細(xì)胞途徑藥物熒光素鈉（CF）作為試驗(yàn)藥物，因?yàn)檫@兩種化合物容易分析，都具有可見光范圍的熒光，檢測(cè)靈敏度高，作為其轉(zhuǎn)運(yùn)方式的標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于各種研究。期望能間接地說明甘草芫花合用前后對(duì)P-gp調(diào)控的規(guī)律性，闡明兩者合用引起毒性增加的可能作用機(jī)制。 內(nèi)容和結(jié)果: 中藥

5、根據(jù)不同產(chǎn)地、不同炮制方法，質(zhì)量存在很大差別，因此要首先對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用的中藥甘草與芫花進(jìn)行鑒別，并制備一定濃度的甘草液、芫花液、甘草芫花合煎液和甘草芫花合并液，用HPLC法建立圖譜，保證實(shí)驗(yàn)過程中藥材質(zhì)量的一致性。流動(dòng)相甲醇：水=1：9，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，流速：1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20μL。HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘草芫花合煎液與合并液圖譜存在差異，這種差異是否會(huì)造成不同煎煮工藝對(duì)腸粘膜P-gp的調(diào)控的不同，有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究

6、。 使用體外Ussing chamber實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)R123、CF經(jīng)空腸粘膜的經(jīng)時(shí)吸收方向和分泌方向的累計(jì)透過率和表觀滲透系數(shù)（Papp），測(cè)定不同濃度維拉帕米（P-gp經(jīng)典抑制劑）對(duì)R123和CF經(jīng)空腸粘膜透過性的影響。結(jié)果R123在空腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)滲透系數(shù)分泌方向大于吸收方向（約為四倍），表明其在小腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)是以分泌為主，說明泵出系統(tǒng)的存在。細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的CF不受腸粘膜P-gp的介導(dǎo)，分泌方向和吸收方向的Papp近似相等（ER=1

7、.08）；試驗(yàn)濃度的維拉帕米能夠顯著提高R123的吸收，并且能夠明顯抑制其分泌方向上的轉(zhuǎn)運(yùn)，而對(duì)CF在腸粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)則無影響。這些結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明在我們實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行Ussing chamber實(shí)驗(yàn)是可行的。 將大鼠灌胃不同濃度各種中藥液，1周后用體外Ussing chamber法評(píng)價(jià)各種藥液對(duì)R123和CF經(jīng)空腸粘膜透過性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的甘草液可以增加R123經(jīng)空腸粘膜的吸收，對(duì)其分泌的影響則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

8、P>0.05）；芫花液、合煎液以及合并液均可以減少R123分泌方向的透過，增加其吸收方向的透過。甘草對(duì)CF經(jīng)空腸粘膜透過無影響，而其他3組藥液則可顯著減少CF吸收和分泌方向的透過性。 建立測(cè)定R123血藥濃度的高效液相-熒光檢測(cè)法。流動(dòng)相為乙腈-1%三乙胺（28：72），流速為1.0 mL·min-1；熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)為485 nm（激發(fā)波長(zhǎng)），546 nm（發(fā)射波長(zhǎng)）。R123檢測(cè)濃度在15.625～500 ng·mL-1范圍內(nèi)

9、線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為S=5420.2C+341494（R2=0.9997），最低檢測(cè)限為5 ng·mL-1，血漿樣品的提取回收率和方法回收率理想，日內(nèi)與日間RSD均小于4%，樣品提取后24h內(nèi)及5次凍融穩(wěn)定性良好。 大鼠灌胃各種藥液后，利用在體In situ實(shí)驗(yàn)測(cè)定R123和CF在血漿中藥物濃度的變化，計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草組R123最高血漿濃度Cmax、曲線下面積AUC0-240min和生物利用度F與對(duì)照組比較無

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而芫花組、合煎組和合并組Cmax、AUC0-240min和F均大于對(duì)照組（P<0.01），并且合煎組與合并組AUC0-240和F與芫花組相比，增加了將近一半，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而合煎組與合并組比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；大鼠灌胃芫花后，CF的各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論和討論： 結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推斷芫花可以顯著抑制P-gp的表達(dá)。那么在臨床上，芫花有可能配伍一些

11、易產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤藥物，或者制成腫瘤藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)劑，以增加抗癌療效；也可以嘗試在藥物的制備中，適當(dāng)加入芫花，改善一些P-gp底物藥物的吸收。而芫花對(duì)CF的作用可能是芫花一方面抑制其吸收，另一方面抑制分泌，吸收和分泌量都減少，從而導(dǎo)致其最終生物利用度與對(duì)照組無差異，這結(jié)果與芫花是P-gp的抑制劑并不矛盾。 中醫(yī)素有“十方九草，無草不成方”之說，甘草配伍其他藥物可以起到增強(qiáng)藥物療效的作用。實(shí)驗(yàn)表明甘草對(duì)P-gp有輕微抑制趨勢(shì)，甘

12、草可能是通過直接或間接對(duì)P-gp的調(diào)控作用，改變了胃腸粘膜通透性，從而引起不同藥物吸收的增加。這為將來對(duì)甘草“調(diào)和諸藥、增強(qiáng)療效”的作用機(jī)制研究，提供了一個(gè)很好的方向，可以試圖從甘草對(duì)腸粘膜中各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響方面進(jìn)行研究，科學(xué)地認(rèn)識(shí)甘草對(duì)不同轉(zhuǎn)運(yùn)方式的藥物經(jīng)胃腸道粘膜滲透和吸收影響的可能機(jī)制，從而為臨床廣泛應(yīng)用甘草配伍其他藥物提高療效提供更多的依據(jù)。 甘草芫花合用后與單用芫花相比，對(duì)P-gp抑制作用增強(qiáng)，但是合煎與合并兩種炮制

13、方法對(duì)P-gp的影響無差異。說明合煎液與合并液色譜圖的不同對(duì)兩者對(duì)腸粘膜P-gp的調(diào)控?zé)o影響。我們可以推斷甘草與芫花配伍有毒，可能是甘草對(duì)芫花有協(xié)同作用，使芫花中某些抑制P-gp表達(dá)的化學(xué)成分作用加強(qiáng)，從而使芫花中有毒成分的分泌減少，吸收增加而導(dǎo)致其產(chǎn)生毒性作用；從另一方面考慮，芫花與甘草合用產(chǎn)生毒性，也有可能是芫花使甘草中一些有毒的物質(zhì)（P-gp底物）吸收增加，這還有待于未來的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。 在課題研究中由于時(shí)間、精力等原因，也