體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞中ANXA7及其下調(diào)與共相關(guān)蛋白ALG-2、SODD的表達(dá)和對細(xì)胞增殖遷徙的影響.pdf

1、背景:
　　細(xì)胞失控性增殖和細(xì)胞凋亡異常，也就是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、死亡之間平衡的機(jī)制被破壞，是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。原發(fā)性肝癌屬于上皮來源惡性腫瘤，是我國常見的惡性腫瘤之一，也是惡性程度最高的腫瘤之一，現(xiàn)在首選治療方法是根治性手術(shù)，但是術(shù)后五年的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率仍居高不下。無限度的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的最主要特征。其中遷徙和轉(zhuǎn)移潛能是最重要的標(biāo)志之一。肝癌具有高轉(zhuǎn)移潛能而其轉(zhuǎn)移方式分為血道轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移

2、，也是病患預(yù)后差、死亡率高的最重要影響因素，但對于肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移及其相關(guān)問題的研究，特別是對其所涉基因和蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控變化的特點，和對腫瘤細(xì)胞增殖與遷徙能力的影響，迄今報道仍然很少見。眾所周知，蛋白是細(xì)胞功能的執(zhí)行者，但它們并不能獨(dú)自發(fā)揮功能而是和其它蛋白或亞基相互調(diào)節(jié)共同作用。因此研究蛋白之間的相互關(guān)聯(lián)對探討蛋白質(zhì)的作用機(jī)制有重要裨益，更有利于降低惡性腫瘤病患復(fù)發(fā)率及死亡率，為臨床應(yīng)用提供新的治療思路。
　　目的:
　　本

3、實驗通過蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)和免疫熒光技術(shù)確定腫瘤細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域沉默子(Suppressor Of Death Domains，SODD)和凋亡相關(guān)基因2(apoptosis-linked gene-2 protein，ALG-2)為膜聯(lián)蛋白A7(Annexin A7，ANXA7)的共相關(guān)蛋白，對比觀察下調(diào)小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞ANXA7基因表達(dá)對ALG-2、SODD基因及蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)而分析ANXA7與共相關(guān)蛋白SODD、AL

4、G-2間的作用機(jī)制。
　　方法:
　　利用蛋白質(zhì)免疫沉淀技術(shù)，驗證在真核細(xì)胞內(nèi)SODD和ALG-2是否為ANXA7的共相關(guān)蛋白。采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，ANXA7、ALG-2、SODD三種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位。構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA7和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞，得到PAnxa7下調(diào)細(xì)胞、PAnxa7無關(guān)序列細(xì)胞。應(yīng)用即時熒光定量PCR技術(shù)在mRNA

5、水平、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上，共同驗證體外Hca-P細(xì)胞、PAnxa7下調(diào)細(xì)胞、PAnxa7無關(guān)序列細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)，分析ANXA7水平下調(diào)對其共相關(guān)蛋白SODD、ALG-2轉(zhuǎn)錄和翻譯是否存在影響。利用Transwell實驗觀察Hca-P組、PAnxa7下調(diào)組、PAnxa7無關(guān)序列組細(xì)胞穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)，驗證下調(diào)ANXA7對腫瘤細(xì)胞遷徙、轉(zhuǎn)移的影響。CCK8實驗分別測得在0小時、24小時、48小時、72小時的光密度值，

6、驗證下調(diào)ANXA7對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　蛋白質(zhì)免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的Hca-P細(xì)胞中，SODD、ALG-2蛋白條帶出現(xiàn)在加入ANXA7抗體組，而加入Normal IgG對照時未出現(xiàn)SODD、ALG-2蛋白條帶，說明ANXA7與ALG-2、SODD在Hca-P細(xì)胞內(nèi)為共相關(guān)蛋白。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，ANXA7及ALG-2在細(xì)胞漿鄰近細(xì)胞膜處共定位，ANXA7及SODD也在細(xì)胞漿內(nèi)共定位表達(dá)。在mRNA

7、水平上成功轉(zhuǎn)染的PAnxa7下調(diào)組與PAnxa7無關(guān)序列組相比，ANXA7的基因表達(dá)下降至原基因水平的21％，ALG-2下降至原基因水平的16％，SODD下降至原基因水平的10％。在蛋白質(zhì)水平上PAnxa7下調(diào)組與PAnxa7無關(guān)序列組相比，ANXA7的表達(dá)下降至原蛋白水平的23％，ALG-2下降至原蛋白水平的21％，SODD下降至原蛋白水平的28％。這些結(jié)果充分表明，ANXA7表達(dá)受到抑制后，SODD、ALG-2蛋白的表達(dá)也明顯降低。

8、Transwell細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗表明，PAnxa7下調(diào)組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平均是35.5±3.11，PAnxa7無關(guān)序列組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平均是96..25±2.22，Hca-P組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平均是107.25±4.57，提示ANXA7表達(dá)下調(diào)后，穿透小室膜的腫瘤細(xì)胞數(shù)目顯著減少。Transwell細(xì)胞侵襲實驗表明，PAnxa7下調(diào)組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平均是21.34±3.21，PAnxa7無關(guān)序列組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平

9、均是80.33±8.62，Hca-P組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目平均是84±3.61，提示ANXA7表達(dá)下調(diào)后，穿透基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞數(shù)目顯著減少。CCK8實驗分別測得在0小時、24小時、48小時、72小時三種細(xì)胞的吸光度值，Hca-P細(xì)胞分別為0.103±0.011、0.167±0.013、0.462±0.027、0.537±0.026; PAnxa7下調(diào)組細(xì)胞分別為0.105±0.009、0.133±0.011、0.241±0.017、0.

10、301±0.010; PAnxa7無關(guān)序列組細(xì)胞分別為0.106±0.015、0.158±0.016、0.413±0.021、0.494±0.018，提示PAnxa7下調(diào)細(xì)胞增殖速度比Hca-P細(xì)胞、PAnxa7無關(guān)序列細(xì)胞慢。
　　結(jié)論:
　　在小鼠Hca-P細(xì)胞中ANXA7與SODD、ALG-2為共相關(guān)蛋白;ANXA7與ALG-2多在胞漿內(nèi)鄰近胞膜處互相結(jié)合，ANXA7與SODD多在胞漿中互相結(jié)合;并且SODD、ALG-