昆蟲酚氧化酶免疫學(xué)功能及其對(duì)殺蟲劑等外來干擾因子的響應(yīng).pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase,EC.1.14.18.1,PO),又稱酪氨酸酶,在昆蟲的正常發(fā)育過程中具有重要的生理作用。它主要參與表皮的硬化、黑化過程；參與對(duì)外來侵染物的免疫防御反應(yīng)；參與傷口愈合反應(yīng)。研究酚氧化酶的特性及其在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中的活性變化和生理功能對(duì)開發(fā)以酚氧化酶為靶標(biāo)的新型害蟲控制劑具有重要的理論意義。本文在前人的研究基礎(chǔ)之上,以黃粉蟲和小菜蛾為材料,研究了酚氧化酶在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中的活性變化、生理學(xué)意義及免

2、疫學(xué)功能。 1.為了本研究的簡(jiǎn)便易行,首先比較了傳統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)比色法與酶標(biāo)儀微量法在測(cè)定酚氧化酶活性和蛋白質(zhì)含量方面的異同。研究發(fā)現(xiàn),兩者都能準(zhǔn)確地測(cè)定酚氧化酶的活性和蛋白質(zhì)含量,但是相比而言,酶標(biāo)儀微量法更簡(jiǎn)捷、方便、靈活,對(duì)試劑的消耗更少,重復(fù)性更穩(wěn)定。 2.研究了黃粉蟲蛻皮后血淋巴和體壁中的酚氧化酶活性變化。剛完成蛻皮過程的幼蟲血淋巴中PO活性較高,但隨著蛻皮后時(shí)間的延長(zhǎng),其活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在3～4小時(shí)內(nèi)達(dá)

3、到最低點(diǎn),而后PO活性逐漸上升,7小時(shí)的酶活性上升至最高,并接近于正常幼蟲；在剛蛻完皮后的1小時(shí)內(nèi),體壁PO活性基本沒有變化,但隨后即開始下降,3小時(shí)左右降到最低點(diǎn),然后開始回升,6～7小時(shí)左右恢復(fù)到正常水平,并趨于穩(wěn)定；通過雙倒數(shù)曲線做圖法求得黃粉蟲血淋巴PO的Km=1.176mmol/L,體壁PO的Km=0.881mmoI/L,表明血淋巴和體壁中的酚氧化酶可能是不同的同工酶,體壁PO催化能力要高于血淋巴PO。 3.研究了抑制

4、劑槲皮素對(duì)黃粉蟲血淋巴酚氧化酶的生理效應(yīng)。結(jié)果表明,在離體條件下,槲皮素對(duì)黃粉蟲血淋巴PO的IC50為0.625 mmol/L;在活體情況下,當(dāng)槲皮素-DMSO溶液或槲皮素水懸浮液(5 μL)注入蟲體后,在濃度低于1 mmol/L時(shí)對(duì)黃粉蟲血淋巴PO具有激活作用,當(dāng)濃度高于2 mmol/L時(shí)則對(duì)PO具有明顯的抑制作用：?jiǎn)为?dú)注射5 μL DMSO溶液對(duì)PO活性亦有一定的激活作用,但是注射水對(duì)酚氧化酶活性沒有影響。試蟲被注射不同濃度的槲皮素

5、后,PO活性在2～4 h內(nèi)迅速下降,然后緩慢上升,處理后8 h左右達(dá)到最高點(diǎn),其后低濃度處理PO活性保持不變,而高濃度處理則逐漸下降,表明低濃度槲皮素可以在一定程度上引起試蟲的免疫反應(yīng)。在PO測(cè)活體系中加入0.5％的牛血清蛋白(BSA)后對(duì)PO活性無影響,并能使槲皮素在測(cè)活體系中保持穩(wěn)定。 4.以大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株為免疫刺激因子,研究了黃粉蟲在受到細(xì)菌侵染后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及酚氧化酶活性變化。

6、結(jié)果表明,大腸桿菌水懸浮液與黃粉蟲血淋巴一起冰浴后,其血淋巴酚氧化酶活性明顯上升,大約為對(duì)照的2.4倍；將血淋巴進(jìn)行離心除去血細(xì)胞后與E. coli-起冰浴,則不能使酚氧化酶活性升高；但是將離心后的血淋巴與胰蛋白酶一起冰浴,隨著胰蛋白酶濃度的升高,酚氧化酶活性也逐漸升高,說明血漿中有酚氧化酶酶原(PPO)存在；綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為黃粉蟲體內(nèi)對(duì)入侵病原菌E.coli起識(shí)別作用的識(shí)別因子存在于血細(xì)胞或其它大分子的表面,這些細(xì)胞或大分子在離

7、心過程中被除去,因而血漿與E. coli冰浴后不能啟動(dòng)PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng),即不能使酚氧化酶活性升高。將病原菌E. coli采用注射法注入黃粉蟲體內(nèi)1小時(shí)后,黃粉蟲體內(nèi)很快出現(xiàn)黑色的結(jié)節(jié)(nodules),表明很快就發(fā)生了免疫防御反應(yīng),10小時(shí)后結(jié)節(jié)數(shù)量達(dá)到最高峰,嚴(yán)重時(shí)大量的結(jié)節(jié)可聯(lián)結(jié)成片；在結(jié)節(jié)形成的同時(shí),黃粉蟲血淋巴酚氧化酶的活性亦發(fā)生變化,在E. coli注入的初期,酚氧化酶活性大幅下降,12小時(shí)左右達(dá)到最低點(diǎn),然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酚

8、氧化酶活性逐漸恢復(fù),20小時(shí)左右恢復(fù)到正常水平,說明酚氧化酶參與了結(jié)節(jié)的形成。 5.研究了經(jīng)丁烯氟蟲腈抗性篩選后抗性小菜蛾與敏感小菜蛾酚氧化酶活性的變化。結(jié)果表明：無論是抗性品系還是敏感品系,其酚氧化酶都有相近的Km值,分別是1.108mmol/L和1.114mmol/L,但最大反應(yīng)速度有明顯的差別,抗性品系PO的最大反應(yīng)速度為153.84 μmol/L·min-1·mg-1蛋白,敏感品系PO的最大反應(yīng)速度為67.114μmol

9、/L·min-1·mg-1蛋白,抗性品系是敏感品系的2.29倍；抗性品系和敏感品系酚氧化酶的最適pH均為6.5,并且均在pH 7.0處最為穩(wěn)定；抗性品系酚氧化酶在pH=5.5的環(huán)境下較敏感品系酚氧化酶穩(wěn)定,兩者在pH=4.4的環(huán)境下均不穩(wěn)定,且蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性而產(chǎn)生沉淀；兩者具有相似的溫度穩(wěn)定性,即在25～40℃范圍內(nèi)相對(duì)較為穩(wěn)定,溫度高于40℃時(shí)活性明顯下降。以上數(shù)據(jù)說明,抗性品系與敏感品系相比較具有較高的酚氧化酶活性,酚氧化酶可能對(duì)昆

10、蟲抗性的產(chǎn)生具有重要的貢獻(xiàn)。 6.以5種不同類型與4種不同作用機(jī)制的殺蟲劑為脅迫因子,研究了其在亞致死劑量下對(duì)黃粉蟲血淋巴酚氧化酶活性的影響：氨基甲酸酯類的滅多威與沙蠶毒素類的殺蟲單對(duì)酚氧化酶的活性影響相似,即在較高的劑量濃度下可提高酚氧化酶活性,而低劑量濃度下對(duì)酚氧化酶活性無明顯影響；有機(jī)磷類的毒死蜱在亞致死劑量下可降低酚氧化酶的活性；擬除蟲菊酯類的高效氯氰菊酯在亞致死劑量下對(duì)酚氧化酶活性無影響；昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類的除蟲脲在亞致