抗DR5單克隆抗體對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的生長及細(xì)胞因子分泌的影響.pdf

1、背景及目的:
　　 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫炎性疾病，慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié)，反復(fù)發(fā)作，呈對稱分布。在病理改變方面，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要累及關(guān)節(jié)滑膜，后可波及到關(guān)節(jié)軟骨、骨組織、關(guān)節(jié)韌帶和肌腱。RA發(fā)病與全身性自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化及關(guān)節(jié)局部滑膜組織中滑膜細(xì)胞異常增生有關(guān)。
　　 人滑膜細(xì)胞主要分為A型

2、、B型和C型三種，B型細(xì)胞即滑膜成纖維樣細(xì)胞（Fibroblast-like synovial cells，F(xiàn)LS），是滑膜組織的重要組成部分[1]，能分泌各種蛋白酶、細(xì)胞因子和花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)能破壞關(guān)節(jié)和加速病程[2]。
　　 本次實(shí)驗(yàn)擬在體外獲得RA患者的滑膜成纖維樣細(xì)胞(FLS)，并應(yīng)用Anti-DR5mAb和caspase抑制劑研究Anti-DR5mAb對FLS生長

3、的影響和對細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化RA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，通過3次傳代獲得FLS;通過免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測vimentin、CD14的表達(dá)。
　　 采用MTT法檢測Anti-DR5mAb對FLS生長抑制作用，檢測caspase抑制劑對Anti-DR5mAb誘導(dǎo)FLS生長抑制作用的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測Anti-DR5mAb誘導(dǎo)FLS后DR5的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率，

4、檢測caspase抑制劑和Anti-DR5mAb對FLS細(xì)胞周期的影響。免疫熒光Hochest33342檢測Anti-DR5mAb誘導(dǎo)FLS凋亡的形態(tài)變化。Western blot檢測 pro-caspase8、pro-caspase3、pro-caspase9、active-caspase3、active-caspase9、Bid、survivin、p38MAPK和NF-κ B蛋白表達(dá)。ELISA和RT-PCR分別檢測FLS細(xì)胞分泌T

5、NF-α、IFN-γ、TGF-β1的蛋白及mRNA水平表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化膝關(guān)節(jié)滑膜組織，通過3次傳代，得到的第3代滑膜細(xì)胞（原代細(xì)胞為第0代細(xì)胞）在形態(tài)上均一，呈長梭形，有一定的增殖能力。該細(xì)胞的vimentin表達(dá)呈陽性，CD14的表達(dá)為陰性，表明所獲得的細(xì)胞為RA的滑膜成纖維樣細(xì)胞(FLS)，并能傳代培養(yǎng)。
　　 MTT結(jié)果顯示Anti-DR5mAb對FLS有細(xì)胞毒性作用，作

6、用12h后呈時(shí)間劑量依賴性。當(dāng)Anti-DR5 mAb的濃度分別為:1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.3μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml時(shí)，作用4h對FLS細(xì)胞的生長抑制率分別為:5.4±1.7％、6.9±2.4％、10.7±4.8％、12.5±5.1％、10.9±1.0％、8.8±2.9％;作用12h對FLS細(xì)胞的生長抑制率分別為:12.2±0.6％、17.2±0.6％、23.8±0.3％、25.3

7、±0.6％、26.2±0.1％、37.3±0.6％;作用24h對FLS細(xì)胞的生長抑制率分別為:6.6±0.9％、13.2±0.6％、34.8±3.5％、49.6±3.3％、51.6±2.6％、53.2±2.0％。當(dāng)Anti-DR5 mAb濃度分別為0μg/ml、1.6μg/ml、6.3μg/ml和50μg/ml，流式細(xì)胞術(shù)檢測DR5表達(dá)率分別為17.10％、20.30％、27.10％和45.90％;誘導(dǎo)FLS細(xì)胞24h的凋亡率分別為1.

8、11％、20.72％、34.87％。免疫熒光Hochest33342染色發(fā)現(xiàn)50μg/ml組的細(xì)胞核有明顯的碎裂，細(xì)胞凋亡作用明顯，鼠源IgG與PBS組相比，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，無核固縮。ELISA檢測到Anti-DR5 mAb作用FLS細(xì)胞24h后分泌TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的蛋白水平降低;RT-PCR檢測Anti-DR5 mAb作用FLS細(xì)胞24h后細(xì)胞TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的mRNA表達(dá)水平降低。West

9、ern blotting檢測到Anti-DR5 mAb誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞內(nèi)pro-caspase8、pro-caspase3、Bid和p38MAPK蛋白表達(dá)上調(diào)，survivin和NF-κ B蛋白表達(dá)下降。
　　 MTT法分析，當(dāng)Anti-DR5 mAb濃度為50μg/ml、caspase抑制劑的濃度分別為0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM和35μM時(shí)，F(xiàn)LS細(xì)胞的死亡率分別為49.45±0.84％、4

10、6.72±0.87％、41.41±0.80％、36.67±0.76％、29.56±0.81％、21.89±0.94％、14.38±0.87％、10.43±0.86％。流式檢測FLS的細(xì)胞周期，Anti-DR5mAb主要阻滯FLS的G0/G1期和G2/M期，與正常對照組相比，50μg/mlAnti-DR5mAb組的G0/G1期和G2/M期比例顯著增高(P＜0.05)，S期無顯著變化;加入caspase抑制劑后，能抑制Anti-DR5mAb

11、對FLS G0/G1期的阻滯，與Anti-DR5mAb組相比，50μg/ml Anti-DR5mAb+35μM caspase抑制劑組的G0/G1期比例顯著下降(P＜0.01)，S期和G2/M期無顯著變化。ELISA結(jié)果顯示，與正常組相比，Anti-DR5mAb組和Anti-DR5mAb+caspase抑制劑組的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的表達(dá)下降顯著(P＜0.001，P＜0.01);與Anti-DR5mAb+caspase抑

12、制劑組相比，Anti-DR5mAb組的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1的表達(dá)下降顯著(P＜0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，Anti-DR5mAb組的pro-caspase3、active-caspase3、pro-caspase9、active-caspase9、Bid、p38MAPK的表達(dá)均增加，差異顯著(P＜0.05)，survivin和NF-κB的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，Anti-DR5m

13、Ab+caspase抑制劑組的active-caspase3、和active-caspase9表達(dá)均降低，差異非常顯著(P＜0.001);與Anti-DR5mAb組相比，Anti-DR5mAb+caspase抑制劑組的pro-caspase3、active-caspase3、pro-caspase9、active-caspase9和p38MAPK的表達(dá)均顯著增加(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.001，P＜0.05)，

14、survivin、NF-κ B的表達(dá)顯著下降(P＜0.001，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.獲得了人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞(FLS)，并能傳代培養(yǎng);
　　 2.Anti-DR5 mAb能抑制FLS生長，作用12h后隨時(shí)間的延長和劑量的增加呈依賴性，并通過阻滯FLS的G0/G1期和G2/M期誘導(dǎo)FLS發(fā)生凋亡，;
　　 3.Anti-DR5 mAb與FLS細(xì)胞膜上的DR5結(jié)合，通過cas