抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生的中藥藥效評(píng)價(jià)方法研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎并侵蝕軟骨、最終導(dǎo)致骨與關(guān)節(jié)破壞為特征的世界難治性自身免疫性疾病。其發(fā)病率較高，世界約0.5～1％、我國(guó)約0.32～0.36％，致殘率也高，給社會(huì)和家庭帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。RA的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，也無特效療法。已知新生血管形成伴隨著滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，是RA血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)內(nèi)新生血管增生的程度與患者的病情、滑膜增生及

2、炎細(xì)胞浸潤(rùn)的程度成正相關(guān)，通過抑制血管生成的藥物可以緩解RA的病情。因此，延緩甚至阻斷RA病人的滑膜血管新生已成為當(dāng)前國(guó)際RA治療的有效策略之一。
　　RA既屬中醫(yī)的痹癥范疇，也屬中醫(yī)的絡(luò)病范疇，其病機(jī)與絡(luò)脈痹阻相關(guān)，為“毒損肢節(jié)絡(luò)脈、絡(luò)道亢變、絡(luò)脈虛滯”，這與RA的“滑膜炎癥-血管新生-損傷”的現(xiàn)代病機(jī)特點(diǎn)相似?，F(xiàn)代研究認(rèn)為RA絡(luò)病的實(shí)質(zhì)與滑膜血管新生有關(guān)。中醫(yī)臨床研究顯示，具祛風(fēng)勝濕、活血化瘀、蟲類搜風(fēng)等“通絡(luò)開痹”功效的中藥

3、具有較好的抗RA滑膜血管新生作用。提示從中藥寶庫(kù)中開發(fā)具有抑制血管新生作用的抗風(fēng)濕改善病情藥物(DMARDs)的可能。然而目前國(guó)內(nèi)外均未建立適合中藥整體作用特點(diǎn)的抗RA滑膜血管新生藥效機(jī)理評(píng)價(jià)方法，嚴(yán)重影響了具有抗RA滑膜血管新生作用的中藥新藥的研發(fā)，使其國(guó)際化進(jìn)程受到限制。因此，積極探索和建立適合中醫(yī)藥的抗RA滑膜血管新生的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法是當(dāng)前中醫(yī)藥治療RA研究中的重要課題。
　　本研究針對(duì)RA的病因病機(jī)特點(diǎn)以及滑膜血管形成的病

4、理機(jī)制，從RA單純疾病模型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型、RA病證結(jié)合模型(風(fēng)寒濕證和風(fēng)濕熱證)、細(xì)胞模型等方面，通過藥效評(píng)價(jià)、機(jī)理探討、檢測(cè)分析，構(gòu)建了抗RA滑膜血管新生的中藥藥效評(píng)價(jià)模型。并選擇雷公藤甲素、通絡(luò)開痹中藥復(fù)方(清絡(luò)飲和溫絡(luò)飲)和抗RA寒證經(jīng)典方劑(烏頭湯)作為干預(yù)，較好地探索了所建立的藥效評(píng)價(jià)方法的合理性和規(guī)范性。本研究所建立的抗RA滑膜血管新生的中藥藥效評(píng)價(jià)方法和模式，為其他同類中藥藥效評(píng)價(jià)方法的構(gòu)建提供有意義的參考

5、。
　　中藥藥效評(píng)價(jià)是中藥研究的難點(diǎn)。本研究建立的評(píng)價(jià)方法還有很多不足，有待進(jìn)一步完善，如：沒有建立SCID-HuRAg嵌合體等可供動(dòng)態(tài)觀察滑膜血管新生過程的整體動(dòng)物模型以及血管內(nèi)皮細(xì)胞和RA滑膜成纖維細(xì)胞(RA-HFLS)共培育誘導(dǎo)滑膜血管生成過程的體外細(xì)胞模型。另外，所建立病證結(jié)合模型尚處于探索階段，如風(fēng)寒濕或風(fēng)濕熱等刺激因素的誘導(dǎo)能否直接導(dǎo)致與臨床RA風(fēng)寒濕證或風(fēng)濕熱證相同病理變化的產(chǎn)生等等，需要更深層次的研究。中藥整體調(diào)節(jié)

6、作用與現(xiàn)代的組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)特性相似，下一步可從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度進(jìn)行相關(guān)研究。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1抗RA滑膜血管新生中藥藥效評(píng)價(jià)模型建立。
　　本研究中，我們分別采用CIA敏感品系DA大鼠和非敏感品系SD大鼠成功復(fù)制了能反映RA I}缶床癥狀和滑膜血管新生病變的CIA，其中采用DA大鼠的造模成功率100％，SD大鼠的造模成功率87.5％，但與SD大鼠相比，DA大鼠價(jià)格昂貴來源極少，故價(jià)廉易

7、得的SD大鼠能大大降低抗RA新藥研發(fā)的成本，同樣適合于抗RA的藥物活性篩選，而且更適合于大規(guī)模的復(fù)制。
　　方證對(duì)應(yīng)是中藥發(fā)揮療效前提，需要采用中醫(yī)證的模型才能較好地評(píng)價(jià)中藥療效。本研究在RA單純疾病模型CIA的基礎(chǔ)上，給予動(dòng)物一定的風(fēng)寒濕或風(fēng)濕熱條件干預(yù)，模擬中醫(yī)臨床“風(fēng)、寒、熱、濕”等多種病因夾雜致病特點(diǎn)和“毒損絡(luò)脈”的病機(jī)特點(diǎn)，分別制作出RA的寒(風(fēng)濕)證與熱(風(fēng)濕)證模型，并根據(jù)中醫(yī)動(dòng)物模型擬臨床主觀癥狀客觀化的研究思路，

8、從關(guān)節(jié)表面溫度、關(guān)節(jié)疼痛閾值、關(guān)節(jié)表面血流速度、全血粘度等這些符合中醫(yī)證型臨床客觀指標(biāo)作為主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，建立針對(duì)模型寒熱證候特點(diǎn)的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)體系。結(jié)果顯示，模擬病因制作的RA寒(風(fēng)濕)證與熱(風(fēng)濕)證動(dòng)物模型，既有明顯的寒/熱證癥狀，又有明顯的RA特征。
　　針對(duì)滑膜血管形成的病理機(jī)制，我們建立了抗RA滑膜血管新生的體內(nèi)體外活性篩選模型，以便從深層次闡明藥物的作用靶點(diǎn)。包括：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖、遷移、黏附和管腔

9、形成實(shí)驗(yàn)，RA-HFLS的增殖、遷移和黏附實(shí)驗(yàn)；體內(nèi)單純血管生成模型--小鼠基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)。其中，RA=HFLS攜帶RA滑膜炎癥反應(yīng)特有的遺傳信息，結(jié)合HUVEC能反映RA炎癥反應(yīng)對(duì)血管新生的影響。
　　2抗RA滑膜血管新生藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)建立。
　　從關(guān)節(jié)紅腫、畸形等臨床癥狀觀察、臨床積分、發(fā)病率、腫脹度、首次發(fā)病時(shí)間、關(guān)節(jié)滑膜組織炎性增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度以及由其介導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷程度(關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查和影像學(xué)技術(shù))等方面評(píng)價(jià)R

10、A藥效；通過關(guān)節(jié)滑膜組織血管新生情況(常規(guī)病理和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的免疫組化技術(shù))和基質(zhì)膠子中血管生成情況(組織病理學(xué)檢查)評(píng)價(jià)血管新生病變程度，從而建立抗RA滑膜血管新生藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)體。
　　3基于血管形成過程的抗RA滑膜血管新生作用機(jī)理評(píng)價(jià)指標(biāo)建立。
　　針對(duì)滑膜血管形成的復(fù)雜過程和調(diào)控機(jī)制，觀察了體外培養(yǎng)的m.WEC和RA-HFLS的增殖、遷移、黏附和管腔形成能力，同時(shí)觀察了體外和/或體內(nèi)血管新生的調(diào)控通路VE

11、GF/VEGFR和Ang/Tie2及炎癥相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)情況，從而構(gòu)建抗RA滑膜血管新生的藥物作用機(jī)理評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　4抗RA滑膜血管新生中藥藥效評(píng)價(jià)方法的驗(yàn)證。
　　以傳統(tǒng)抗RA中藥雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素為驗(yàn)證對(duì)象，通過CIA大鼠關(guān)節(jié)炎紅腫癥狀表現(xiàn)、臨床積分和發(fā)病率以及病理學(xué)檢查考察對(duì)RA的療效，采用組織病理學(xué)HE染色和CD31特染方法考察對(duì)滑膜血管新生的作用，并通過考察體外HUVEC和RA-HFLS的增殖、遷移、

12、黏附和管腔形成能力及血管新生調(diào)控通路因子的表達(dá)情況進(jìn)行機(jī)理探討，結(jié)果顯示雷公藤甲素具有抑制RA滑膜血管新生的作用。通過雷公藤甲素比較全面的驗(yàn)證，證明了所建立評(píng)價(jià)方法的規(guī)范性和合理性。
　　從RA“絡(luò)病”與血管增生的關(guān)系入手，通過具有“通絡(luò)”作用的寒、溫屬性不同的復(fù)方清絡(luò)飲、溫絡(luò)飲對(duì)大鼠CIA、小鼠基質(zhì)膠栓模型和體外RA-HFLS和HUVEC實(shí)驗(yàn)及相關(guān)藥效和機(jī)理評(píng)價(jià)指標(biāo)的驗(yàn)證，結(jié)果顯示清絡(luò)飲抑制RA滑膜血管新生的作用優(yōu)于溫絡(luò)飲，初步

13、提示CIA可能具有RA脈絡(luò)瘀阻證的生物學(xué)表征，可能更適合于具有中醫(yī)治則治法的寒性中藥研究。
　　辨證論治是中醫(yī)藥發(fā)揮療效的前提。以CIA疾病模型為對(duì)照，通過抗RA寒痹證經(jīng)典方劑烏頭湯對(duì)RA寒(風(fēng)濕)證的“對(duì)證”和RA熱(風(fēng)濕)證的“不對(duì)證”的驗(yàn)證，考察所建RA寒(風(fēng)濕)證和熱(風(fēng)濕)證模型的合理性和可靠性，結(jié)果顯示烏頭湯治療RA寒(風(fēng)濕)證滑膜血管新生的作用優(yōu)于CIA，對(duì)熱(風(fēng)濕)證模型沒有明顯作用，初步提示RA寒(風(fēng)濕)證模型可

14、能一定程度地反映RA寒證證候特征，適合于具有明顯熱性中藥的研究。結(jié)合烏頭湯對(duì)RA寒(風(fēng)濕)證模型的有效性和對(duì)熱(風(fēng)濕)證的無效結(jié)果，提示中醫(yī)“療寒以熱”的合理性。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.從滑膜血管新生環(huán)節(jié)切入研究抗RA的中藥藥效評(píng)價(jià)方法學(xué)，具有較新的研究理念和較高的國(guó)際認(rèn)可度，國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　2.采用體內(nèi)和體外、局部和系統(tǒng)、形態(tài)和功能、藥效和機(jī)制相結(jié)合的研究模式建立相關(guān)藥效評(píng)價(jià)方法較符合中藥的整體作