清絡(luò)飲和溫絡(luò)飲抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生作用的比較研究.pdf

1、目的:
　　 研究比較清絡(luò)飲和溫絡(luò)飲對(duì)RA滑膜血管新生的干預(yù)作用并探索相關(guān)機(jī)制,為指導(dǎo)RA臨床的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為中醫(yī)絡(luò)病學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵研究提供方法學(xué)參考。
　　 方法:
　　 SD大鼠清絡(luò)飲、溫絡(luò)飲水煎液連續(xù)灌胃五次后,末次灌胃后1h腹主動(dòng)脈采血分離血清,制得清絡(luò)飲含藥血清(QX)溫絡(luò)飲含藥血清(WX)。分設(shè)以下組:正常鼠血清組(Con)、IL-1β誘導(dǎo)正常鼠血清組(Mod)、QX(5％、10％、20％

2、)組,WX(5％、10％、20％)組。30％乙醇回流提取清絡(luò)飲、溫絡(luò)飲制得清絡(luò)飲醇提物(QL)、溫絡(luò)飲醇提物(WL)。分設(shè)以下組:空白組(Con)、IL-1β誘導(dǎo)組(Mod)、IL-1β誘導(dǎo)+QL(2、4、8mg／ml)組、IL-1β+WL(2、4、8、16、32mg／ml)組。
　　 將不同濃度的清絡(luò)飲、溫絡(luò)飲分別與IL1-β誘導(dǎo)的RA-HFLS及未誘導(dǎo)的HUVEC共孵育,采用MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,以觀察清、溫絡(luò)飲對(duì)R

3、A-HFLS和HUVEC增殖的影響:通過Transwell雙室培養(yǎng)板觀察清、溫絡(luò)飲RA-HFLS和HUVEC趨化性遷移的影響:采用細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一FN包被96孔培養(yǎng)板,考察清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS和HUVEC細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附作用的影響:通過基質(zhì)膠包被的96孔板來觀察清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS和HUVEC管腔形成能力的影響:以及通過在體實(shí)驗(yàn)觀察清、溫絡(luò)飲對(duì)小鼠基質(zhì)膠栓子中血管形成的影響；ELISA法檢測(cè)清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFL

4、S分泌的血管新生相關(guān)細(xì)胞因子(VEGF、Ang1、Ang2、TNFα、IL-17)及HUVEC血管新生相關(guān)受體蛋白VEGFR2和Tie2表達(dá)水平的影響的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS增殖、遷移、黏附及血管新生相關(guān)因子的影響
　　 1.1.清、溫絡(luò)飲對(duì)IL1-β誘導(dǎo)的RA-HFLS增殖的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,IL-1β可明顯提高細(xì)胞的增殖活性；QX組對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的RA-

5、HFLS增殖無(wú)明顯影響；WX組隨著濃度的增大,抑制作用逐漸增強(qiáng),WX20可顯著抑制RA-HFLS的增殖(P<0.05)；QL在較低濃度2～8mg／ml即可抑制RA-HFLS的增殖,而WL在高劑量16～32mg／ml組才可顯著抑制RA-HFLS的增殖(P<0.01或P<0.05),且呈現(xiàn)劑量依賴性；同時(shí)TP10、50組亦可劑量依賴性的抑制RA-HFLS的增殖(P<0.01)
　　 1.2.清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS遷移的影響

6、>　　 與空白對(duì)照組相比,VEGF可明顯提高RA-HFLS細(xì)胞的遷移數(shù)量；隨著QX濃度增大,QX20組可顯著抑制其遷移(P<0.05)隨著WX濃度增大,WX10,20組均可顯著抑制其遷移(P<0.05或P<0.01)；同時(shí)QL可劑量依賴性的抑制RA-HFLS細(xì)胞的遷移(P<0.05或P<0.01):WL組隨濃度增大WL8～32組均可顯著抑制其遷移。TP組隨濃度增大,可劑量依賴性的抑制RA—HFLS的遷移。
　　 1.3.清、溫

7、絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS黏附的影響
　　 與空白組相比,RA-HFLS對(duì)FN有較強(qiáng)的黏附能力(P<0.01)；同時(shí)IL-1β誘導(dǎo)可顯著增加RA-HFLS對(duì)FN的黏附(P<0.05)；QX,WX隨濃度的增大,對(duì)RA-HFLS黏附能力均無(wú)顯著影響。QL,WL隨濃度的增大,QL4、QL8,WL16、WL32組均可顯著降低RA-HFLS黏附能力(P<0.05或P<0.01)。TP濃度的增大,TP10、50組可顯著降低RA-HFLS黏附能力(

8、P<0.01)。
　　 1.4.清、溫絡(luò)飲對(duì)RA-HFLS分泌的血管新生相關(guān)因子(TNFα、IL-17、VEGF、Ang1、Ang2)的影響
　　 (1)對(duì)炎性因子TNFα、IL-17水平的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,IL1-β誘導(dǎo)組可增加RA-HFLS上清中TNFα、IL-17水平,QX對(duì)TNFα的影響無(wú)顯著性差異,QX20能顯著降低幾-17水平,而WX20組較IL1-β誘導(dǎo)組TNFα、IL-17水平顯著降低

9、(P<0.05或P<0.01)；QL4～8、WL16～32組可顯著抑制TNFα、1L-17的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)TP可劑量依賴性的抑制RA-HFLS分泌IL-17,而TP10、50組對(duì)TNFα的抑制作用具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
　　 (2)對(duì)血管新生相關(guān)因子VEGF,Ang1,Ang2的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,IL1-β誘導(dǎo)組可增加RA—HFLS上清中VEGF、Ang1、Ang2

10、水平,QX、WX對(duì)VEGF、Ang1、Ang2的影響無(wú)顯著性差異。QL組對(duì)RA—HFLS分泌Ang2無(wú)明顯影響,QL4～8組可顯著抑制上清中VEGF、Ang1水平(P<0.05或P<0.01)；WL8～32組亦可顯著抑制上清中Ang1水平,而只有WL32組可明顯抑制VEGF、Ang2的表達(dá)。TP組可劑量依賴性的降低VEGF、Ang1水平(P<0.05或P<0.01)。只有TP50組Ang2水平顯著降低(P<0.05)。
　　 2

11、.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC增殖,遷移,黏附,管腔形成及血管新生相關(guān)受體蛋白VEGFR2和Tie2表達(dá)水平的影響
　　 2.1.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC增殖的影響
　　 濃度增大,QX10和QX20組均可顯著抑制HUVEC增殖；WX組劑量依賴性的抑制其增殖(P<0.01),QL、WL組隨著濃度增大,QL2、QLA,WL16、WL32均可顯著抑制HUVEC增殖(P<0.01),但是同劑量組相比,QL較WL對(duì)HUVEC增殖的抑制作

12、用強(qiáng)。TP10、50組均可顯著抑制RA.I-IFLS的增殖(P　　 2.2.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC遷移的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,VEGF可明顯提高HUVEC細(xì)胞的遷移數(shù)量；隨著QX、WX濃度增大,QX20、WX20組可顯著抑制其遷移(P<0.05或P<0.01)；QL組可劑量依賴性的抑制其遷移(P<0.05或P<0.01)；隨著WL濃度增大WL8-32組的遷移作用明顯降低,而TP組可劑量依賴性的抑制

13、RA-HFLS的遷移。
　　 2.3.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC黏附的影響
　　 與空白組相比,HUVEC對(duì)FN有較強(qiáng)的黏附能力(P<0.01)；同時(shí)IL-1β誘導(dǎo)可顯著增加HUVEC對(duì)FN的黏附(P<0.05)；QX,WX隨濃度的增大,對(duì)HUVEC黏附能力均無(wú)顯著影響。而QL可劑量依賴性的抑制HUVEC的黏附(P<0.05或P<0.01),隨著WL濃度的增大,WL16、WL32可顯著降低HUVEC黏附能力(P<0.05或P

14、<0.01)。同時(shí)TP組隨著濃度的增大,均可顯著降低HUVEC黏附能力(P<0.01)。
　　 2.4.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC管腔形成的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,VEGF誘導(dǎo)可顯著增加HUVEC在基質(zhì)膠上的管腔形成,QL、WL、TP組隨著濃度的增加均可劑量依賴性的抑制HUVEC的管腔形成(P<0.01)。
　　 2.5.清、溫絡(luò)飲對(duì)HUVEC血管新生相關(guān)受體蛋白VEGFR2和Tie2表達(dá)水平的影響
　　

15、 與空白對(duì)照組相比QX,WX均可劑量依賴性的促進(jìn)HUVEC的VEGFR2、Tie2的表達(dá)(P<0.01),QL,WL組隨濃度增大,Tie2的表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì),除WL2組外,均具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；QL8、WL16～32組可顯著促進(jìn)VEGFR2的表達(dá)(P<0.01)；TP組與空白對(duì)照組相比TP10、TP50可顯著上調(diào)Tie2的表達(dá)水平(P<0.01),而只有高劑量的TP才可顯著促進(jìn)VEGFR2的表達(dá)。

16、　　 3.清、溫絡(luò)飲30％乙醇提取物對(duì)在體小鼠基質(zhì)膠栓子中血管形成的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,VEGF誘導(dǎo)組見基質(zhì)膠內(nèi)部可見大量血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn),且有管樣結(jié)構(gòu)形成,說明VEGF有促進(jìn)血管新生的作用:QL8,WL32,TP50組較VEGF誘導(dǎo)組相比,血管內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少。
　　 4.結(jié)論
　　 根據(jù)國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展,借助體外培養(yǎng)的RA-HFLS和HUVEC細(xì)胞模型以及在體的小鼠基質(zhì)膠栓子模型成功模擬

17、了實(shí)驗(yàn)性RA滑膜血管新生病理過程,并以此為基礎(chǔ)得到如下結(jié)論:
　　 (1)清、溫絡(luò)飲均具有顯著的RA滑膜血管新生抑制作用,但清絡(luò)飲的作用顯著強(qiáng)于溫絡(luò)飲。
　　 (2)清、溫絡(luò)飲對(duì)RA滑膜炎癥的抑制作用可能是通過抑制RA-HFLS的增殖、遷移和黏附及炎癥因子。TNFα、IL-17和促血管新生因子VEGF、Ang1的分泌來實(shí)現(xiàn)的；而對(duì)血管新生的抑制作用則可能與其對(duì)HUVEC增殖、遷移、黏附的抑制以及對(duì)血管新生相關(guān)受體Tie2