實(shí)時(shí)定量PCR法分析2型糖尿病患者腸道乳酸桿菌菌種數(shù)量的改變.pdf

1、[研究背景]
　　 隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年升高趨勢(shì)，正逐漸成為威脅人類健康的“頭號(hào)殺手”之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的發(fā)生機(jī)制除了與基因及飲食結(jié)構(gòu)、體力活動(dòng)等環(huán)境因素有關(guān)之外，還與腸道菌群關(guān)系密切。研究表明，2型糖尿病患者或動(dòng)物模型與正常對(duì)照者相比腸道菌群構(gòu)成發(fā)生了改變，這可能是引起胰島素抵抗及糖尿病的因素。還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過改變飲食因素使腸道菌群構(gòu)成發(fā)生變化能引起肥胖，進(jìn)而增加糖尿病

2、的風(fēng)險(xiǎn)。因此腸道菌群與代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為國(guó)內(nèi)外研究的新熱點(diǎn)。人體消化道定植著相當(dāng)復(fù)雜又相對(duì)穩(wěn)定的腸道菌群，在能量代謝、免疫防御、合成人體必需的微量元素及礦物質(zhì)等方面發(fā)揮著不可替代的作用。其中，乳酸桿菌普遍存在于人類消化道中，并且經(jīng)常作為益生菌加入食品中。目前，腸道微生物與人類健康的相互作用仍存在分歧，它們影響人體代謝的機(jī)制仍不十分清楚。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，服用干酪乳酸桿菌能減輕大鼠的肥胖及胰島素抵抗。然而也有實(shí)驗(yàn)表明，乳酸桿菌

3、能引起炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)又與肥胖及2型糖尿病有關(guān)。
　　 [目的]
　　 本研究擬從腸道菌群角度，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，比較我國(guó)2型糖尿病人群與血糖正常人群腸道總?cè)樗釛U菌及其具體菌種（嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）數(shù)量的差異，并且分析乳酸桿菌數(shù)量與血糖、血脂等代謝性指標(biāo)的相關(guān)性，從而為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供新線索，為2型糖尿病的防治尋求新靶點(diǎn)。
　　 [方法]

4、　　 選取2010年8月——2010年10月在廣東某社區(qū)醫(yī)院病房住院及門診隨診的2型糖尿病病人50人，同時(shí)選取30名健康對(duì)照者，性別、年齡、BMI相匹配，并排除腫瘤、肝腎等臟器嚴(yán)重?fù)p害、患有甲狀腺等其它內(nèi)分泌疾病、1月內(nèi)服用抗生素及微生態(tài)制劑、近4周內(nèi)患腹瀉病或其它胃腸道疾病者。收集每個(gè)2型糖尿病患者空腹血樣品，進(jìn)行空腹血糖(FBG)、胰島素、C肽、糖化血紅蛋白(HbA1C)、血脂（包括TC、LDL-C、HDL-C、TG）、C反應(yīng)蛋白

5、(CRP)濃度測(cè)定，進(jìn)行OGTT試驗(yàn)，收集2h后血樣品進(jìn)行餐后2h血糖(PBG)、胰島素、C肽濃度測(cè)定。收集每個(gè)研究對(duì)象當(dāng)日糞便樣品，稱取濕重糞便樣品每份2g，經(jīng)反復(fù)離心、去除雜質(zhì)、洗滌，得到菌體沉淀，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。根據(jù)待測(cè)目標(biāo)細(xì)菌16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，將10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與糞便細(xì)菌DNA樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同，每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品及空白對(duì)照，

6、每個(gè)樣品均同時(shí)做2個(gè)平行復(fù)孔。反應(yīng)完畢后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，根據(jù)Ct值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每克糞便樣品中待測(cè)細(xì)菌基因的拷貝數(shù)，作為定量結(jié)果。將此定量結(jié)果經(jīng)log10轉(zhuǎn)換后錄入SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異。用K類中心聚類法根據(jù)所含細(xì)菌數(shù)目的差異將所有研究對(duì)象分成相互獨(dú)立的兩類，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩類間目標(biāo)細(xì)菌的差異，用兩獨(dú)立樣本率比較的x2檢驗(yàn)比較兩類中糖尿病患者的百分比來(lái)判斷該分類方法

7、與糖尿病之間是否存在關(guān)聯(lián)，并計(jì)算敏感性、特異性。用Pearson相關(guān)分析總?cè)樗釛U菌拷貝數(shù)與糖尿病患者脂代謝指標(biāo)、糖代謝指標(biāo)、炎癥指標(biāo)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)乳酸桿菌屬及其具體菌種實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，糖尿病組(7.771±0.874)乳酸桿菌含量顯著高于對(duì)照組(6.606±0.586)（P＜0.001）;糖尿病組(4.550±0.674)嗜酸乳桿

8、菌含量顯著高于對(duì)照組(2.904±0.614)（P＜0.001）;糖尿病組(5.016±1.047)干酪乳桿菌含量顯著高于對(duì)照組(4.504±0.938)（P=0.031）;糖尿病組(5.188±0.681)保加利亞乳桿菌含量顯著高于對(duì)照組(4.550±0.674)（P＜0.001);糖尿病組(3.744±0.995）鼠李糖乳桿菌含量顯著高于對(duì)照組(2.730±0.459)（P＜0.001);糖尿病組(4.698±0.938)植物乳桿菌

9、含量低于對(duì)照組(4.619±0.657)，但差異不具有顯著性（P=0.685）。通過聚類分析得到相互獨(dú)立、菌群構(gòu)成特征不同的兩類，其中第一類含有顯著增多的總?cè)樗釛U菌（7.8±0.9P＜0.001）、嗜酸乳桿菌（5.2±1.0 P＜0.001）、保加利亞乳桿菌（5.2±0.6P=0.038）、干酪乳桿菌（5.2±1.2 P=0.007）及鼠李糖乳桿菌（4.0±1.1 P＜0.001)，第二類含有顯著減少的總?cè)樗釛U菌（7.0±0.9 P＜0

10、.001)、嗜酸乳桿菌（2.9±0.6 P＜0.001）、保加利亞乳桿菌（4.8±0.8 P=0.038）、干酪乳桿菌（4.6±0.8 P=0.007）及鼠李糖乳桿菌（2.9±0.6 P＜0.001)。且該分類與糖尿病之間存在聯(lián)系，第一類中糖尿病患者所占百分比顯著高于第二類（x2=25.368 P＜0.001)。本實(shí)驗(yàn)通過腸道菌群分析預(yù)測(cè)糖尿病的敏感性為0.600，特異性為0.967。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示乳酸桿菌與脂代謝指標(biāo)顯

11、著相關(guān)，與糖代謝指標(biāo)、炎癥指標(biāo)之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性?？?cè)樗釛U菌與低密度脂蛋白膽固醇顯著負(fù)相關(guān)（Rp=-0.252P=0.039），與總膽固醇（Rp=-0.215 P=0.067）、甘油三酯（Rp=-0.161 P=0.132）、高密度脂蛋白膽固醇（Rp=-0.157 P=0.138）呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 本研究通過對(duì)乳酸桿菌屬及具體菌種的定量分析比較，可以初步認(rèn)為:乳酸桿菌及其具體菌

12、種嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在2型糖尿病人群和血糖正常人群中存在差異，2型糖尿病人群中上述菌屬及菌種增多。且研究結(jié)果顯示通過分析腸道菌群構(gòu)成的方法來(lái)判斷糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)具有較高的特異性，為2型糖尿病高危人群的判斷及2型糖尿病早期防治提供了新的線索。在所有代謝指標(biāo)中，發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白膽固醇與乳酸桿菌顯著負(fù)相關(guān)?？梢酝茰y(cè)，腸道菌群對(duì)血脂代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。通過飲食調(diào)節(jié)腸道乳酸桿菌含量可能有助于改善糖尿病、高脂血癥等