2型糖尿病患者與健康個(gè)體之間腸道雙歧桿菌的差異研究.pdf

1、[研究背景]
　　 隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高，糖尿病尤其是2型糖尿病的患病率在全球范圍內(nèi)急劇上升。有數(shù)據(jù)顯示，目前全球糖尿病患病人數(shù)已達(dá)2.4億，專(zhuān)家預(yù)測(cè)到2025年，該數(shù)字將突破3億。糖尿病的廣泛流行，不僅嚴(yán)重威脅到人類(lèi)的健康，同時(shí)也給整個(gè)社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，糖尿病的預(yù)防和治療已成為一個(gè)重大的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 探討和研究2型糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制，是預(yù)防和治療2型糖尿病的基礎(chǔ)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)2型

2、糖尿病患病率的增高，不能僅僅歸因于人類(lèi)基因、飲食結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)狀況的改變，平均壽命的延長(zhǎng)，或是平日運(yùn)動(dòng)的減少，腸道菌群是控制體重和能量代謝的一個(gè)重要環(huán)境因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)。
　　 腸道菌群是個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞群體，它包含有數(shù)量巨大、種類(lèi)繁多、約1014細(xì)菌細(xì)胞，其數(shù)量是人類(lèi)基因數(shù)量的100倍還多。有學(xué)者認(rèn)為，腸道菌群可被看作是人體內(nèi)的一個(gè)“微生物器官”，這個(gè)“微生物器官”在體內(nèi)發(fā)揮著許多重要的功能。目前已有研

3、究表明，腸道菌群是參與脂代謝、促進(jìn)肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病發(fā)生的一個(gè)重要因素。2型糖尿病患者存在腸道菌群的失調(diào)，表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌含量增加，類(lèi)桿菌含量減少等。腸道菌群可以顯著增加宿主能量的攝取、增加脂肪的儲(chǔ)存，可以通過(guò)增加腸道中單糖的吸收和肝臟甘油三酯的合成等途徑來(lái)促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，從而引起2型糖尿病的發(fā)生。還有學(xué)者認(rèn)為，飲食因素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)，可產(chǎn)生對(duì)機(jī)體不利的代謝產(chǎn)物并引起代謝性?xún)?nèi)毒素血癥，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)并出

4、現(xiàn)胰島素抵抗，最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。
　　 雙歧桿菌是人體腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，也是常見(jiàn)的的益生菌之一，在維持腸道菌群與宿主之間相互作用的穩(wěn)定、保證宿主正常的新陳代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。雙歧桿菌數(shù)量的減少可導(dǎo)致整個(gè)腸道菌群失調(diào)和腸道微生態(tài)失衡，從而導(dǎo)致許多代謝性疾病的發(fā)生。有研究表明，雙歧桿菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖誘發(fā)的胰島素分泌功能，降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠內(nèi)毒素血癥和血漿脂肪組織的促炎癥因子水平，使小鼠的低濃

5、度炎癥好轉(zhuǎn)，從而改善糖尿病代謝紊亂的狀態(tài)。還有研究發(fā)現(xiàn)，青春雙歧桿菌可以有效改善2型糖尿病大鼠腸道菌群的失調(diào)和脂質(zhì)代謝紊亂等癥狀。同時(shí)，雙歧桿菌已被廣泛用于腸道相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，并表現(xiàn)出很好的功效。許多雙歧桿菌及含雙歧桿菌的制劑可以通過(guò)口服途徑來(lái)促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，在腸道菌群相關(guān)疾病的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，研究2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌的變化規(guī)律有著十分重要的意義。
　　 腸道菌群的定量是了解2型糖尿病患者腸道

6、菌群變化規(guī)律的有效技術(shù)手段，目前國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用傳統(tǒng)的細(xì)菌定量方法來(lái)研究，即培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。但該方法操作過(guò)程中容易受到外界環(huán)境、培養(yǎng)基、操作方法等因素的影響，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力效率低，而且計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，其結(jié)果缺乏穩(wěn)定性。因此，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確定量腸道菌群的穩(wěn)定方法是十分必要的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是一種敏感性高、特異性強(qiáng)的定量方法，可以快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地對(duì)腸道菌群進(jìn)行定量，并且具有高通量、污染小、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　 目前關(guān)于2型

7、糖尿病患者與健康個(gè)體之間腸道雙歧桿菌差異的研究仍較少，并且國(guó)內(nèi)外對(duì)于雙歧桿菌的不同菌種在2型糖尿病患者腸道中如何變化的研究尚屬空白。本課題根據(jù)不同細(xì)菌的16SrRNA序列設(shè)計(jì)屬種特異性引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)2型糖尿病患者和健康個(gè)體的腸道雙歧桿菌（包括雙歧桿菌總菌及其常見(jiàn)的4個(gè)菌種:長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）進(jìn)行定量分析，并分析這些腸道細(xì)菌與2型糖尿病患者臨床特征的相關(guān)性，從而為進(jìn)一步研究腸道雙歧桿菌

8、與2型糖尿病的關(guān)系提供依據(jù)。
　　 [目的]
　　 1.定量分析2型糖尿病患者和健康個(gè)體之間腸道雙歧桿菌總菌、腸道長(zhǎng)雙歧桿菌、腸道短雙歧桿菌、腸道青春雙歧桿菌、腸道嬰兒雙歧桿菌的差異。
　　 2.分析2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌總菌、腸道長(zhǎng)雙歧桿菌、腸道短雙歧桿菌、腸道青春雙歧桿菌、腸道嬰兒雙歧桿菌與患者的一般臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 [方法]
　　 1.根據(jù)嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，選取廣東省

9、佛山市順德明景糖尿病醫(yī)院的50例2型糖尿病患者及30例前來(lái)體檢的健康志愿者。2型糖尿病患者根據(jù)WHO1999版糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)所有入選者進(jìn)行詳細(xì)的病史及既往體檢資料的詢(xún)問(wèn)，進(jìn)行體表測(cè)量并填寫(xiě)相關(guān)的基線(xiàn)資料登記表，測(cè)量他們的身高、體重等，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)。
　　 2.采集2型糖尿病組入選者的血標(biāo)本，測(cè)定空腹血漿葡萄糖(FPG)、餐后2h血漿葡萄糖(2hPG)、空腹C肽(FCP)、餐后2hC肽(2hPCP)

10、、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。
　　 3.采集所有入選者的糞便標(biāo)本，進(jìn)行糞便標(biāo)本的預(yù)處理:稱(chēng)取濕重糞便樣品每份2g于無(wú)菌離心管中，加入20ml滅菌PBS充分振蕩混勻，反復(fù)離心后收集沉淀（菌體）。
　　 4.糞便細(xì)菌總DNA的提取:按細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，所提取出的DNA通過(guò)紫外分光光

11、度計(jì)測(cè)定。
　　 5.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備:根據(jù)雙歧桿菌總菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的16SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)屬種特異性引物，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因并純化回收PCR產(chǎn)物，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒后，作為陽(yáng)性模板在7500FastReal-timePCRSystem(AppliedBiosystems，USA)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
　　 6.糞便標(biāo)本的細(xì)菌定量:將80份糞便標(biāo)

12、本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，可得到80份糞便標(biāo)本中分別含雙歧桿菌總菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的數(shù)量。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的資料以(x)±s表示，兩組間差異的比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);若不服從正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距P25～P75）表示，組間差異的比較用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。腸道細(xì)菌與

13、各糖脂代謝等指標(biāo)符合正態(tài)分布的采用Pearson相關(guān)分析，若非正態(tài)分布的用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.兩組人群糞便標(biāo)本的細(xì)菌定量:2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的定量結(jié)果分別為10.97(10.25～11.26)、3.49(3.26～3.81)、3.94(3.76～4.13)、3.44(3.34～3.57)、3.

14、80(3.23～4.66)，健康對(duì)照組分別為11.56(10.97～11.92)、3.68(3.30～4.48)、4.02(3.52～4.12)、4.01(3.72～4.28)、4.23(2.92～4.72)。與健康對(duì)照組相比，2型糖尿病組腸道雙歧桿菌總菌和青春雙歧桿菌的數(shù)量均顯著減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（兩者均P=0.000），而長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌的數(shù)量?jī)山M間無(wú)顯著性差異(P=0.101，0.676，0.964)。

15、
　　 2.相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌總菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌拷貝數(shù)與FPG、2hPG、HbA1c、CRP、FCP、2hPCP、TC、TG、HDL-C、LDL-C無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。
　　 [結(jié)論]
　　 1.2型糖尿病患者出現(xiàn)了腸道雙歧桿菌的失調(diào)，表現(xiàn)為雙歧桿菌總菌、青春雙歧桿菌的數(shù)量減少，腸道雙歧桿菌屬、青春雙歧桿菌種可能在2型糖尿病的發(fā)病中起著一定的作用。