Retigeric acid B的抗真菌機制及白色念珠菌中分子工具的構(gòu)建.pdf

1、近三十年，隨著隨著免疫缺陷患者的增多、器官移植的廣泛開展、免疫抑制劑的使用以及腫瘤化療和抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床上真菌感染的發(fā)生率逐年上升。與此同時，由于抗真菌藥物在臨床上的大量使用，導(dǎo)致真菌的耐藥性迅速蔓延。另外，隨著病人用藥時間的延長，造成真菌耐受的出現(xiàn)，這又進一步加劇了臨床真菌感染的治療難度。而臨床上有效的抗真菌藥物品種（尤其是對系統(tǒng)性真菌感染有效的品種）非常有限。因此篩選新的抗真菌藥物，尋找新的抗真菌感染治療策略，探索真菌耐受的形

2、成機制，并針對性的設(shè)計克服真菌耐受的藥物就變得非常重要。
　　 植物藥一直是天然藥物的重要來源，也是人類治療疾病的重要來源之一。其中地衣(lichen)是植物界中一個特殊的類群，是藻類(algae)和真菌(fungi)高度結(jié)合的共生復(fù)合體。文獻報道近些年科學(xué)家們已經(jīng)從地衣植物中分離獲得了許多具有多種生物活性的新化合物。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)對從云南光肺衣中分離得到的retigericacidB(RAB)具有抗白色念珠菌的活性，此化合物

3、具有中等強度的抗真菌活性，最低抑制濃度為8～16μg/ml。本實驗室已有研究報道RAB與臨床唑類藥物（氟康唑、酮康唑、伊曲康唑）聯(lián)合用藥，對從臨床分離得到的白色念珠菌菌株具有協(xié)同抗真菌活性。研究還發(fā)現(xiàn)RAB能夠抑制外派泵的活性，通過下調(diào)ERG11的表達抑制麥角甾醇的合成，從而與唑類藥物產(chǎn)生協(xié)同抗真菌的效果。為了深入研究RAB的抗真菌機制，本課題從RAB對白色念珠菌的毒力、被膜的形成以及細胞增殖、凋亡和壞死等各方面進行了系統(tǒng)的研究，并揭示

4、了其抗真菌機制。此外還對臨床上造成真菌感染復(fù)發(fā)的重要因素耐受進行了初步研究探索，并檢測了RAB對念珠菌耐受的影響。
　　 白色念珠菌作為臨床上的一種機會致病性真菌，其生長形態(tài)具有二相性，它能夠依外界環(huán)境的變化從酵母態(tài)變?yōu)榫z態(tài)。而菌絲態(tài)因其有著粘附和侵襲的優(yōu)勢，容易造成宿主的感染，因而白色念珠菌酵母態(tài)到菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變將顯著增強它的毒力。實驗研究發(fā)現(xiàn)RAB在白色念珠菌菌絲誘導(dǎo)的環(huán)境條件下能夠抑制菌絲的形成，采用秀麗隱桿線蟲作為白色念

5、珠菌的動物感染模型，發(fā)現(xiàn)RAB能夠通過抑制白色念珠菌菌絲的形成，降低其毒力，從而提高線蟲的存活率。為了闡明RAB抑制白色念珠菌菌絲形成的分子機制，采用熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)RAB能夠下調(diào)菌絲調(diào)控的重要信號通路Ras1-cAMP-Efg1，cAMP在此信號通路中發(fā)揮著重要作用，采用cAMPELISA試劑盒測定RAB作用后細胞內(nèi)的cAMP含量，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)cAMP含量隨RAB劑量的增高而降低，當(dāng)補加外源cAMP時，能夠逆轉(zhuǎn)RAB對菌絲的抑制作用

6、，顯示RAB是通過影響cAMP的合成來抑制菌絲的形成。白色念珠菌中合成cAMP的酶為腺苷酸環(huán)化酶Cdc35，將RAB作用后的白色念珠菌細胞進行裂解，將裂解產(chǎn)物作為粗酶，進行腺苷酸環(huán)化酶活性測定，發(fā)現(xiàn)RAB處理后的細胞內(nèi)Cdc35的活力降低，并呈劑量依賴效應(yīng)。將Cdc35進行外源表達然后測定RAB對Cdc35的酶活影響，發(fā)現(xiàn)RAB對體外表達的Cdc35無酶活抑制效果。因而推斷RAB是通過間接的方式影響了Cdc35的活性。有研究報道法尼醇能

7、夠與Cdc35直接作用，抑制Cdc35的活性。采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)檢測RAB處理后細胞分泌的法尼醇含量，發(fā)現(xiàn)法尼醇的含量隨RAB濃度的增高而增加，呈時間和劑量依賴效應(yīng)。采用綠色熒光蛋白與編碼法尼醇合成酶Dpp3進行融合表達，以綠色熒光蛋白的強度作為Dpp3表達量的指針，發(fā)現(xiàn)RAB的加入能夠促進白色念珠菌Dpp3的表達量。此外通過熒光定量PCR和綠色熒光標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)RAB能夠下調(diào)白色念珠菌粘附和侵襲相關(guān)因子如Als3的表達量，從

8、而降低白色念珠菌對宿主細胞的侵襲性?；谝陨辖Y(jié)果得出這樣的結(jié)論:RAB通過上調(diào)Dpp3的表達量，增加法尼醇的分泌，從而抑制Cdc35的活性，降低cAMP的合成，通過Ras1-cAMP-Efg1信號調(diào)節(jié)通路抑制白色念珠菌菌絲的形成，抑制粘附和侵襲相關(guān)因子，降低了白色念珠菌的毒力，提高了被真菌感染的宿主的存活率。
　　 鑒于RAB與臨床唑類藥物具有協(xié)同抗真菌的效果，本課題探索了RAB與唑類藥物聯(lián)合應(yīng)用抑制白色念珠菌菌絲和被膜形成的效

9、果。白色念珠菌菌絲的形成不僅增強了它的毒力，同時也是成熟被膜形成的必要過程。被膜形成后，它對所包裹的細胞形成一種保護，使其對臨床上所用的抗真菌藥物高度耐受，并且產(chǎn)生一些耐受菌，在藥物撤去后，耐受菌繼續(xù)分裂繁殖，造成患者的復(fù)發(fā)感染，因而被膜的形成極大的增加了臨床上白色念珠菌感染的治療難度。體外實驗發(fā)現(xiàn)低劑量的RAB與唑類藥物聯(lián)用能夠顯著抑制白色念珠菌菌絲的形成。采用Balb/C小鼠作為白色念珠菌體內(nèi)動物感染模型，結(jié)果顯示RAB與氟康唑聯(lián)用

10、能夠顯著延長小鼠的存活時間;對小鼠腎組織中的菌量進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥可以顯著降低白色念珠菌對腎組織的侵襲性;腎組織病理切片染色觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組中，白色念珠菌的形態(tài)為酵母態(tài)，而在對照組和藥物單用組中，念珠菌的形態(tài)為菌絲態(tài)。據(jù)此推論RAB與唑類藥物聯(lián)合能夠通過抑制菌絲的形成，降低白色念珠菌的侵襲性，從而提高被感染小鼠的存活率和存活時間。為了進一步驗證RAB與氟康唑能夠抑制白色念珠菌對宿主細胞的侵襲性，采用白色念珠菌與宿主細胞共培養(yǎng)，觀察

11、在藥物作用下，白色念珠菌對宿主細胞的侵襲力和粘附性。實驗結(jié)果顯示RAB與氟康唑聯(lián)用能夠顯著抑制白色念珠菌對宿主細胞的侵襲以及對宿主細胞的粘附。
　　 基于RAB與唑類藥物聯(lián)用抑制白色念珠菌菌絲形成的效果，采用平板微量稀釋法檢測了RAB與唑類藥物聯(lián)用對白色念珠菌中的實驗和臨床菌株的被膜形成作用，并使用FICI模型評估了聯(lián)用效果，結(jié)果顯示RAB與唑類藥物聯(lián)用具有協(xié)同抑制真菌被膜形成的作用;采用激光共聚焦顯微鏡觀察用二乙酸熒光素(FD

12、A，活細胞染色)和碘化丙啶（PI，死細胞染色）雙染的白色念珠菌被膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)單用RAB或者氟康唑處理的白色念珠菌所形成的被膜結(jié)構(gòu)與對照組相比，較為稀疏，菌的形態(tài)主要為菌絲態(tài)，而藥物聯(lián)用組處理的白色念珠菌無法形成被膜，僅有一些散落的酵母態(tài)細胞粘附在介質(zhì)表面，同時藥物聯(lián)用還表現(xiàn)出一定的殺菌效果。3維薄層掃描結(jié)果顯示，對照組中白色念珠菌形成了致密且厚度較高的被膜，而單用RAB或FLC處理后所形成的被膜較對照組稀薄。以上結(jié)果顯示RAB可以與唑類

13、藥物聯(lián)用，通過抑制菌絲的形成，協(xié)同抑制成熟被膜的形成，并表現(xiàn)出一定的殺菌效果。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示RAB能夠降低白色念珠菌多藥耐藥外排泵MDR1的表達，增強其與唑類藥物聯(lián)用的抗真菌效果。
　　 白色念珠菌的酵母態(tài)雖然毒力較弱，但是酵母態(tài)的結(jié)構(gòu)形態(tài)易于其隨血液進行擴散，基于這種擴散特性，抑制白色念珠菌酵母態(tài)的增殖也是一種有效的抗真菌策略。本課題研究發(fā)現(xiàn)RAB能夠通過調(diào)控白色念珠菌的細胞周期抑制其分裂，低劑量的RAB能夠使細胞

14、阻滯在G2/M期，而高劑量的RAB使細胞阻滯在G1期。RAB能夠造成細胞內(nèi)ROS的積累，從而造成DNA損傷，將分裂的細胞阻滯在G2/M期。有研究報道稱一些抗真菌劑能夠降低胞內(nèi)cAMP的含量，抑制G1期相關(guān)蛋白的表達，使細胞阻滯在G1期，從而抑制細胞的分裂增殖。實驗發(fā)現(xiàn)RAB也能夠降低胞內(nèi)cAMP的含量，并呈劑量依賴效應(yīng)，通過外源cAMP回補的方法證明RAB確實是通過降低cAMP的含量使得細胞阻滯的G1期。以上結(jié)果表明RAB能夠促使細胞內(nèi)

15、ROS含量的積聚，并降低胞內(nèi)cAMP的含量，延長細胞周期，從而抑制白色念珠菌的增殖。
　　 此外，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)白色念珠菌細胞受到高劑量RAB（32μg/ml）作用時，細胞表現(xiàn)出壞死的特性。透射電鏡結(jié)果顯示經(jīng)高劑量藥物作用后細胞內(nèi)染色質(zhì)固縮或分散、細胞膜破裂、細胞器出現(xiàn)皺縮。對細胞進行凋亡染色，并用熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)藥物作用后有大量壞死細胞和少量的凋亡細胞。進一步的研究發(fā)現(xiàn)RAB所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞壞死與胞內(nèi)積聚的ROS相關(guān)，這與

16、文獻中報道的抗真菌藥物通過促進ROS增多來發(fā)揮殺菌效果相一致。采用羅丹明123進行染色，并用流式細胞儀進行檢測發(fā)現(xiàn)RAB能夠使得細胞線粒體膜電勢超極化，用ATP檢測試劑盒發(fā)現(xiàn)RAB作用后的細胞內(nèi)ATP含量降低，并呈劑量依賴遞減效應(yīng)。這表明RAB促進了胞內(nèi)ROS的積聚，使得線粒體膜電勢超極化，抑制了ATP的產(chǎn)生，這三個因素共同導(dǎo)致了念珠菌細胞的壞死。
　　 為了研究白色念珠菌的耐受發(fā)生機制，首先要建立快速檢測耐受菌（持留菌）的模型

17、。將糖酵解代謝基因TDH3進行GFP標(biāo)記，念珠菌細胞在受到高劑量殺菌劑兩性霉素B處理后，用GFP陽性、PI陰性細胞作為持留菌的特征進行檢測。同時還用該模型評價了RAB對念珠菌耐受的影響，發(fā)現(xiàn)RAB對降低耐受無明顯作用效果，該結(jié)果與用傳統(tǒng)的評價結(jié)果相一致。為了分選獲得持留菌以便進行基因表達譜分析，進行了不同培養(yǎng)條件的優(yōu)化，得到了持留菌比率較高的培養(yǎng)條件。
　　 為了構(gòu)建一個能夠在白色念珠菌中穩(wěn)定遺傳的分子工具，以便于進行白色念珠菌

18、的遺傳學(xué)研究和抗真菌藥物的篩選。在一個普通的質(zhì)粒骨架上添加真菌抗性篩選標(biāo)記NAT1(抗Nourseothricin)，復(fù)制活性位點ORC984或著絲粒序列CEN4，并將端粒序列放在質(zhì)粒的兩端，用限制性內(nèi)切酶線性化該質(zhì)粒，就成為一個類染色體的人造染色體，將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染白色念珠菌，采用輪廓鉗位均勻電泳(CHEF)并結(jié)合southern雜交的方法確證該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得的克隆子中，線性質(zhì)粒依然能夠保持游離態(tài)，未被整合到基因組中。進一步研究發(fā)現(xiàn)這

19、些克隆子能夠穩(wěn)定遺傳該質(zhì)粒，將功能基因裝載到該質(zhì)粒上，在轉(zhuǎn)化克隆子中能夠表達該目的基因，并穩(wěn)定遺傳。以上結(jié)果顯示上述質(zhì)粒可以作為一種有效的分子工具在白色念珠菌中使用。
　　 本論文詳細論述了從地衣中分離得到的三萜類化合物RAB的抗真菌機制，為三萜類化合物的抗真菌機制提供了理論依據(jù)，并為臨床上治療真菌感染提供了一種可能性。論文中所述的白色念珠菌耐受模型的建立為真菌耐受發(fā)生機制的研究以及抗真菌耐受藥物的篩選奠定了基礎(chǔ)。在白色念珠菌中