白色念珠菌熱休克蛋白90單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、白色念珠菌是一種人和動(dòng)物的常住型寄生菌,棲生于健康宿主的皮膚和黏膜,只有當(dāng)宿主的免疫力下降時(shí),才會(huì)侵入皮膚粘膜內(nèi),進(jìn)而進(jìn)入深層組織和血液循環(huán)系統(tǒng),引起系統(tǒng)性感染或稱深層念珠菌感染。白色念珠菌本身能分泌和合成大量的毒性分子和免疫調(diào)節(jié)因子,它們參與真菌的粘附、降解宿主組織蛋白、調(diào)節(jié)白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換等過(guò)程。其中某些是白色念珠菌的免疫優(yōu)勢(shì)抗原,如熱休克蛋白90、天冬氨酸蛋白酶等,它們可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,并在系統(tǒng)性白色念珠菌感染中起著保護(hù)

2、作用。
　　 隨著癌癥患者在腫瘤治療過(guò)程中化療藥物的長(zhǎng)期使用,導(dǎo)致了患者免疫力下降,這些患者的白色念珠菌的感染也越來(lái)越普遍。現(xiàn)階段人們預(yù)防和治療白色念珠菌感染主要通過(guò)兩個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)進(jìn)行,診斷和抗真菌治療。由于該病沒(méi)有明顯的臨床癥狀,加上現(xiàn)階段臨床上人們對(duì)真菌的檢測(cè)主要通過(guò)血培養(yǎng)法,而這種檢測(cè)方法敏感性差、周期性長(zhǎng),導(dǎo)致無(wú)法對(duì)該病進(jìn)行有效的早期診斷、預(yù)防和治療,病人的死亡率明顯升高,因此如何建立一套白色念珠菌感染的快速檢測(cè)體系對(duì)患者來(lái)

3、說(shuō)將具有重要意義。但抗真菌治療也存在很多問(wèn)題,比如真菌的耐藥性,人們把解決這一難題寄希望于藥物的協(xié)同治療。但抗真菌藥物本身的毒性作用再加上它們之間的拮抗作用,使人們把眼光投到了抗體上,單克隆抗體因其特異性高和細(xì)胞毒性弱等特點(diǎn)成為抗體中的首選。為了進(jìn)一步研究白色念珠菌感染的快速檢測(cè)及抗真菌治療方法,本研究制備了抗白色念珠菌熱休克蛋白90單克隆抗體。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用pGEX-4T-1Hsp90表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)

4、白色念珠菌熱休克蛋白90蛋白,再通過(guò)親和層析法純化熱休克蛋白90重組蛋白,并以熱休克蛋白90重組蛋白為抗原免疫BALB／c小鼠。利用化學(xué)融合法將免疫好的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)HAT、間接ELISA、有限稀釋法等一系列方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選與純化,最后通過(guò)ELISA和Western-blot方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞分泌出的抗體進(jìn)行鑒定,我們得到了兩株分泌抗白色念珠菌熱休克蛋白90雜交瘤細(xì)胞系,并制備了抗白色念珠菌熱休克蛋白90單克隆抗