無性型冬蟲夏草腺苷高產菌株及指紋圖譜的研究.pdf

1、冬蟲夏草為名貴中藥材,味甘性平,有保肺腎、補精髓、化痰止勞咳,以及調節(jié)免疫功能、增強人體對多種疾病抵抗力的功效.但是天然蟲草受自然條件限制,產量有限,滿足不了國內外日益增長的需要,已成為稀世之珍,因而貨源奇缺,供不應求,價格昂貴.目前國內對冬蟲夏草的研究,主要以分析天然蟲草和蟲草菌絲體的腺苷、D-甘露醇和蟲草多糖的含量,從自然環(huán)境分離冬蟲夏草的無性型菌株,以及無性型菌株深層發(fā)酵的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的研究居多.該課題以提高冬蟲夏草菌絲體的主

2、要活性化學成分腺苷的含量為目的,對冬蟲夏草Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.菌株CS-JS進行了菌種選育和發(fā)酵的研究,并初步建立了冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體的毛細管電泳指紋圖譜,為冬蟲夏草菌絲體產品的研發(fā)和產品的鑒別打下了基礎.實驗建立了無性型冬蟲夏草(Cordyceps sinesis(Berk.)Sacc.)CS-JS菌株菌絲體的兩種活性成分D-甘露醇和腺苷的含量測定方法.用80°C水浴40min制備人工蟲草菌絲體D

3、-甘露醇樣品,比色法測定D-甘露醇,在10μg/ml~50μg/ml內呈良好的線性關系(r=0.9999),RSD為1.47％,平均回收率為104.08％,該法簡便準確,重現性好.用超聲處理的方法制備蟲草菌絲體腺苷樣品,HPLC測定其含量,腺苷保留時間為7.6min,在0.016mg/ml-O.24mg/ml濃度范圍內,呈良好的線性關系(r=0.9999),RSD=0.77％.通過酶解細胞壁的方法,優(yōu)化了冬蟲夏草(Cordyceps s

4、inesis(Berk.) Sacc.)CS-JS菌絲體的原生質體制備和再生條件:6天左右菌齡的菌絲體,1％蝸牛酶和1％纖維素酶的酶組合,在pH6.4的甘露醇穩(wěn)滲環(huán)境,36°(C酶解1.5h,可獲得原生質體2.04×10<'9>個/ml.再生培養(yǎng)基為RM3時,再生率為0.091％.以腺苷的高產為主要篩選目標,D-甘露醇和多糖為輔助篩選指標,選取120秒為誘變時間進行原生質體誘變.應用8-AG篩選AMP脫氨酶缺陷型或低活性的突變株的辦法,

5、篩選到腺苷含量提高8.24倍的誘變株CS-JS-16.該篩選模型首次應用于蟲草腺苷高產菌株的篩選,可提高篩選效率.通過對培養(yǎng)條件的研究,確定了冬蟲夏草(Cordyceps sinesis(Berk.) Sacc.)CS-JS-16最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是:蛋白胨0.75％、葡萄糖1.5％、pH6.3、MgSO<,4>0.15％、KH<,2>PO<,4>0.2％.發(fā)酵6天后,最大發(fā)酵量是0.1746g/10ml,最大AR含量是1.0826mg/g