等電聚焦理論、方法研究及其應(yīng)用.pdf

1、等電聚焦(IEF)，作為雙向凝膠電泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE)第一維，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中起著非常重要的作用。它能夠分離各種非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，一直被視為蛋白質(zhì)組學(xué)分析領(lǐng)域的強(qiáng)大工具。本論文研究基于移動中和界面(Moving Neutralization Boundary，MNB)理論，研究了IEF體系運(yùn)行機(jī)制，演繹了一系列I EF理論及其方

2、程，創(chuàng)建了非固化pH梯度等電聚焦（non-IPG-IEF）體系，并利用其可調(diào)性探究了其在2D-PAGE分離方法中的應(yīng)用。
　　本論文共分為六章，主要內(nèi)容概括如下。
　　第一章綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵分離分析技術(shù)，特別是2D-PAGE技術(shù)在組學(xué)研究中的應(yīng)用，并總結(jié)了IEF兩種體系的技術(shù)發(fā)展概況，分析了各自的優(yōu)缺點(diǎn)。隨后著重綜述了與IEF關(guān)系密切的移動中和界面理論的起源、理論方程、理論驗(yàn)證和理論的完善，分析了其與IEF的關(guān)系

3、，最后提出了本論文選題目的、意義和創(chuàng)新點(diǎn)。
　　第二章研究內(nèi)容主要涉及研究電解質(zhì)溶液電導(dǎo)率的新理論方法。在該研究中，單價(jià)離子的遷移率經(jīng)驗(yàn)方程式被選為研究對象。在離子強(qiáng)度≤0.05 mo l/L條件下，我們根據(jù)19種已知單價(jià)電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)率數(shù)據(jù)，對原本存在10％偏差的經(jīng)驗(yàn)方程進(jìn)行了校正。校正后，方程的最大偏差縮小到了4.5％。利用校正后的方程進(jìn)行預(yù)測實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與利用移動界面方法檢測到的鹽離子確切遷移率有高度的一致性，其與在0.1

4、0 mo l/L離子強(qiáng)度下用Lucy方程計(jì)算的32種有機(jī)離子的遷移率也高度吻合。據(jù)此我們推導(dǎo)了一個更準(zhǔn)確的公式條件，其在離子強(qiáng)度<0.02 mol/L下最大偏差值僅為2％。由于離子遷移率的信息可以在參考文獻(xiàn)中找到，且電解質(zhì)電導(dǎo)率的檢測簡便易行，因此本方法使得對于離子遷移率的研究變的非常容易。
　　第三章研究內(nèi)容主要涉及IEF電流理論方程的發(fā)展和no n-IPG-IEF體系的建立。根據(jù)Svensson-Tiselius的微分方程和M

5、NB的概念，以CAs-IEF和IPG-IEF體系中的電流為切入點(diǎn)，建立了CAs-IEF和IPG-IEF體系電遷移電流、擴(kuò)散電流理論及其方程式，結(jié)合MNB判別式理論建立了non-IPG-IEF體系，并由IEF電流理論方程推導(dǎo)出IPG-IEF和non-IPG-IEF體系電導(dǎo)方程，隨后對其進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在這兩類IEF體系電導(dǎo)方程基礎(chǔ)上，提出基于電導(dǎo)檢測的I EF結(jié)果預(yù)評估方法，此方法簡單、實(shí)用，能預(yù)測IPG-IEF和non-IPG-IEF體

6、系運(yùn)行樣品是否含有鹽份、膠條是否水化完全、是否有電極接觸不良等多種問題，從而快速修正實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)效率。
　　第四章研究內(nèi)容主要涉及non-IPG-IEF和IPG-IEF穩(wěn)定性機(jī)制研究。在理論部分，根據(jù)MNB判別式理論深入分析并推導(dǎo)了IPG-IEF體系的判別式Rr值，通過判別式理論比較了 IP G-IEF體系中的氫離子和氫氧根離子的流通量，揭示了IPG-IEF穩(wěn)定性機(jī)制。在兩類IEF體系中，我們在電遷移電流、擴(kuò)散電流理論及其方程式

7、等基礎(chǔ)上，演繹出導(dǎo)致no n-IPG-IEF平原化現(xiàn)象的水生成理論方程，分析了no n-IP G-IEF平原化現(xiàn)象的機(jī)理。最后，通過IP G-IEF體系p H梯度的動員實(shí)驗(yàn)演示，進(jìn)一步印證了前述理論。結(jié)果顯示，(i) IP G-IEF體系由于兩性電解質(zhì)固定在凝膠基質(zhì)上，氫離子和氫氧根離子的流通量基本平衡，固化pH梯度的漂移得到了很好的控制；(ii)由于non-IPG-IEF體系中兩性電解質(zhì)處于游離狀態(tài)，所以體系平衡狀態(tài)時存在高擴(kuò)散電流，

8、但是IPG-IEF體系中僅有微弱的電流存在；(iii)高的擴(kuò)散電流導(dǎo)致了 non-IPG-IEF體系中水的生成量增加，進(jìn)而產(chǎn)生較嚴(yán)重的平原化現(xiàn)象。
　　第五章研究內(nèi)容主要是基于MRB理論的新型可調(diào)non-IPG-IEF體系的創(chuàng)建。在該體系中，通過選擇不同 R值的電極液對，演示了不同電極液對的IEF調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，然后以模式蛋白為樣品分別進(jìn)行了IPG-IEF與no n-IP G-IEF，對其分辨率和靈敏度進(jìn)行了分析。隨后，分別以模式蛋白和

9、結(jié)腸癌細(xì)胞全蛋白為樣品，利用2DE分析軟件PD Quest分析比較了IPG-IEF和可調(diào)的non-IPG-IEF作為第一向的2DE結(jié)果的分辨率和靈敏度。結(jié)果顯示，(i)通過選擇不同的電極液對可以創(chuàng)建基于MRB的可調(diào)的pH梯度；(ii)使用non-IPG-IEF能夠取得1.65倍的分辨率改善，no n-IPG-IEF作為第一向的2DE能夠分辨模式蛋白的亞型，而這在IPG-IEF中是不能實(shí)現(xiàn)的；(iii)以可調(diào)的non-IPG-IEF為第一