血小板在庫存紅細胞輸注增強患者炎癥反應中的作用及機制研究.pdf

1、背景
　　同種異體輸血(allogeneicbloodtransfusion,ABT)在臨床搶救病人過程中發(fā)揮著重要作用,但同種異體輸血在挽救生命的同時,也會并發(fā)很多免疫相關的副反應。輸血相關免疫調節(jié)(transfusion-relatedimmunomodulation,TRIM)[1]是輸入同種異體血液導致免疫系統(tǒng)改變的以免疫抑制為特征的綜合征,臨床常見的并發(fā)TRIM導致免疫抑制的嚴重后果為術后感染和腫瘤的復發(fā)與轉移。懸浮紅細

2、胞在保存過程中,含有的白細胞及血小板可以釋放多種生物活性物質,這些生物活性物質的濃度會隨著保存時間的延長而升高,當這些生物活性物質進入機體后有可能導致受者免疫狀態(tài)發(fā)生改變,導致TRIM的后果。
　　TRIM發(fā)生的確切機制尚不清楚。目前的研究已知,各種刺激信號必須與其相應靶細胞膜上的受體結合,通過其特定的信號傳導通路發(fā)揮生物學作用。最近的研究中發(fā)現(xiàn)血小板不僅在止血和凝血過程中發(fā)揮重要作用,血小板還參與了很多炎癥反應。血小板是外周血體

3、積最小的血細胞,由巨核細胞的胞漿部分脫落形成,含有致密顆粒和α顆粒,激活后可以釋放多種細胞因子和生長因子,如可溶性CD40配體(sCD40L)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、轉化生長因子β(TGFβ)、RANTES等。在紅細胞保存過程中,血小板非常容易活化,從而釋放大量生物活性因子,關于這些生物活性因子在TRIM中的作用,,國內外相關文獻報道較少。
　　目的探討血小板在輸注庫存紅細胞增強患者炎癥反應中

4、的作用及機制。
　　方法
　　1.庫存紅細胞上清制備:
　　取新鮮采集懸浮紅細胞3袋,用無菌接合機與無菌空袋接合混合后,放置在4℃冰箱中保存。分別于7d、21d、35d用無菌接合機與無菌空袋接合留取樣本,通過4000g離心,將紅細胞上層液體擠入無菌空袋,得到含有少量紅細胞的上清,大約130ml。將此上清以無菌的方式倒入無菌EP管中,以10000g離心,以去除紅細胞,得到紅細胞上清。將此上清分裝成6分,放入-80℃冰箱保

5、存。
　　2.實驗分組:
　　將150ml新采集的機采血小板用同型血漿稀釋后,用無菌接合機與血小板保存袋連接擠入40ml血小板,依此方法再重復12次。任選其中4袋血小板以無菌的方式全部加入7d庫存紅細胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方式加入濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS45ul并標記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入28d庫存紅細胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方

6、式加入45ul濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入35d庫存紅細胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方式加入45μl濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標記好。最后剩下一袋血小板什么都不加,即:
　　A組:對照組,稀釋后的機采血小板40ml。
　　B組:加入5ml7d或21d或35d紅細胞上清的45ml機采血小

7、板。
　　C組:加入5ml7d或21d或35d紅細胞上清和45μl濃度為10ng/ml的LPS
　　D組:加入5ml7d或21d或35d紅細胞上清和45μl濃度為100ng/ml的LPS
　　E組:加入5ml7d或21d或35d紅細胞上清和45μl濃度為1000ng/ml的LPS
　　3.結果檢測:
　　分別于3h、6h、24h以無菌方式在血小板中取出10ml,其中1ml用于血小板凋亡、活化檢測,2ml用于

8、細胞因子檢測,其余用于血小板聚集率及低滲性休克檢測。使用流式細胞儀檢測CD62P及血小板凋亡;血小板低滲休克反應采用分光光度法檢測;血小板聚集率使用血小板聚集儀檢測;CD40L、5-HT、TGF-β1、RANTES、IL-1β、TNF-α使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。
　　結果
　　1.sCD40L檢測結果
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,sCD40L濃度隨庫存紅細胞上清時間延長而增加(P<0.05);

9、在相同庫存紅細胞上清中,sCD40L濃度隨血小板保存時間延長而增加(P<0.05);在同等條件下,sCD40L濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　2.5-HT檢測結果
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,5-HT濃度隨庫存紅細胞上清時間延長而增加(P<0.05);在相同庫存紅細胞上清中,5-HT濃度隨血小板保存時間延長而增加(P<0.05);在同等條件下,5-HT濃度隨溶液中LPS濃度增

10、加而增加(P<0.05)。
　　3.TGF-β1檢測結果
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,TGF-β1濃度隨庫存紅細胞上清時間延長而增加(P<0.05),在相同庫存紅細胞上清中,TGF-β1的釋放在3h、6h處沒有差別(P>0.05),在7d紅細胞上清的刺激下TGF-β1的釋放并沒有隨時間的延長而增加(P>0.05)),但在21d、35d紅細胞上清刺激下,TGF-β1在24h處釋放明顯增加(P<0.05

11、);在同等條件下,TGF-β1濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　4.RANTES檢測結果
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,RANTES濃度隨庫存紅細胞上清時間延長而增加(P<0.05),在相同庫存紅細胞上清中,RANTES的釋放在6h、24h處沒有差別(P>0.05),但與3h相比差異明顯(P<0.05)。在同等條件下,RANTES濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。

12、
　　5.IL-1β檢測結果
　　在7d上清刺激下,IL-1β的釋放隨保存時間延長而增加(P<0.05);在21d、35d上清刺激下,3h、6h處IL-1β的釋放并未隨時間延長而增加(P>0.05),但在24h處IL-1β的釋放隨時間延長而增加(P<0.05)。在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,IL-1β的釋放隨保存紅細胞上清時間延長而增加(P<0.05)。在同等條件下,IL-1β的濃度隨溶液中LPS濃度增加

13、而增加(P<0.05)。
　　6.CD62檢測結果
　　在7d上清刺激下,CD62P的表達在6h、24h處并未隨時間延長而增加(P>0.05);在21d、35d上清刺激下,CD62P的表達隨時間延長而增加(P<0.05)。在同等條件下,CD62P的表達隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　7.血小板聚集率檢測
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,血小板聚集率隨庫存紅細胞上清時間延長

14、而降低(P<0.05),在相同庫存紅細胞上清中,血小板聚集率隨庫存紅細胞上清時間延長而降低(P<0.05);在同等條件下,血小板聚集率隨溶液中LPS濃度增加而降低(P<0.05)。
　　8.血小板低滲性休克檢測結果
　　在各組加入不同庫存紅細胞上清孵育后相同檢測時間點,血小板低滲性休克率隨庫存紅細胞上清時間延長而降低(P<0.05);在相同庫存紅細胞上清中,血小板低滲性休克率隨庫存紅細胞上清時間延長而降低,但不具有統(tǒng)計學意義

15、(P>0.05);在同等條件下,血小板低滲性休克率隨溶液中LPS濃度增加而降低(P<0.05)。
　　9.AnnexinV檢測結果
　　在各時間點及各紅細胞上清刺激下統(tǒng)計結果均無明顯差異(P>0.05)。
　　10.TNF-α檢測結果
　　所有樣本中均未檢測到TNF-α。
　　結論
　　1.懸浮紅細胞保存時間越長,其上清刺激血小板產生致炎因子的能力越強。
　　2.懸浮紅細胞保存時間越長,其上清對