儲存紅細胞輸注促進細菌感染引發(fā)肝損傷及其作用機制研究.pdf

1、儲存紅細胞（red blood cells,RBCs）輸注能誘導創(chuàng)傷后炎癥、增強感染、引發(fā)膿毒血癥、導致感染性并發(fā)癥，是導致患者死亡的獨立危險因素，但其具體機制尚不明確。因此，要解決儲存RBCs輸注誘導創(chuàng)傷后炎癥及增強感染這一臨床問題，必須加強對其致病機制的研究。
　　機體各重要器官，尤其是肝臟，在細菌感染的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。同時，肝臟在衰老RBCs的清除中也發(fā)揮著重要的作用，是快速清除RBCs和鐵循環(huán)的主要器官。根據(jù)肝

2、臟在細菌感染及RBCs清除中的調(diào)節(jié)活性及“儲存紅細胞誘導創(chuàng)傷后炎癥并增強感染”的理論，我們推測：儲存RBCs輸注增強細菌感染，可能與儲存RBCs輸注加重細菌感染引發(fā)的肝損傷密切相關(guān)。為對上述推測進行驗證，本研究將基于可視化監(jiān)測技術(shù)監(jiān)測儲存RBCs促進細菌感染并引發(fā)肝損傷的作用過程，并對其機制進行探索。雖然Kupffer細胞與細菌感染誘導的肝損傷密切相關(guān)，而且儲存RBCs輸注與巨噬細胞之間關(guān)系也已經(jīng)被證實，但儲存RBCs輸注對細菌感染后肝

3、臟Kupffer細胞的影響，以及其對肝細胞內(nèi)信號傳導通路的影響至今未見相關(guān)報道，特別是在細菌感染期間輸注儲存RBCs后對肝臟Kupffer細胞極化和活化的調(diào)控機制仍不清楚。因此，本研究將探討儲存RBCs輸注加重細菌感染并促進肝損傷是否與Kupffer細胞介導的免疫應答有關(guān)，并分析其引發(fā)肝損傷的分子機制，旨在了解儲存RBCs對肝臟損傷的調(diào)控及其對細菌感染的影響，為創(chuàng)傷患者安全輸血提供科學依據(jù)，對提高臨床輸血安全性和有效性具有重要意義。

4、r>　　本研究分以下三個部分展開：
　　1.儲存RBCs輸注在體內(nèi)增強銅綠假單胞菌誘導的肝損傷
　　首先，通過發(fā)光細菌的體外成像，證實細菌的熒光素酶活性與細菌CFU的數(shù)目成正相關(guān)。通過尾靜脈注射銅綠假單胞菌（典型的革蘭氏陰性細菌）誘導菌血癥建立小鼠模型，利用活體成像分析小鼠體內(nèi)的細菌感染情況。細菌的生物發(fā)光讀數(shù)與通過常規(guī)計數(shù)確定的細菌CFU數(shù)呈正相關(guān)，證明生物發(fā)光可以應用于監(jiān)測細菌增殖的變化。為了研究儲存的RBCs輸注對銅綠

5、假單胞菌誘導細菌感染的影響，在菌血癥小鼠模型中觀察新鮮和儲存 RBCs輸注后的效應，結(jié)果表明，輸入儲存的RBCs可以加劇銅綠假單胞菌感染并降低小鼠的存活率。同時根據(jù)細菌體內(nèi)成像的信號顯示，感染的最初4h內(nèi)肝臟區(qū)域熒光信號最強，說明經(jīng)靜脈感染的銅綠假單胞菌早期主要聚集在小鼠肝臟。儲存RBCs輸注進一步導致細菌感染小鼠血清ALT和AST的水平升高，與肝切片的組織學檢查結(jié)果一致。上述實驗結(jié)果表明，儲存RBCs的輸注促進體內(nèi)細菌增殖，增強銅綠假

6、單胞菌誘導的肝損傷，加劇細菌感染的嚴重程度。
　　2.儲存RBCs輸注增強細菌感染引發(fā)的肝損傷與Kupffer細胞的極化相關(guān)
　　為了確定輸注儲存RBCs的促炎作用，在銅綠假單胞菌感染的小鼠中監(jiān)測促炎細胞因子IL-6，IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。當銅綠假單胞菌感染的小鼠輸注儲存的RBCs時，感染后2h血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平顯著高于輸入新鮮RBCs的小鼠。上述實驗結(jié)果表明儲存RBCs輸

7、注可以增強細菌感染的全身炎癥反應。為進一步探討這些炎癥細胞因子的產(chǎn)生是否與巨噬細胞相關(guān)，將離體骨髓來源的巨噬細胞（bonemarrow-derived macrophage，BMDM）與儲存RBCs或新鮮RBCs孵育后，再加LPS刺激，結(jié)果顯示儲存RBCs組的上清液中IL-6和TNF-α水平顯著高于新鮮RBCs組，表明與儲存RBCs的孵育顯著增強巨噬細胞的活化。通過流式細胞術(shù)測定F4/80+巨噬細胞亞型標記物，結(jié)果表明：與用新鮮RBCs

8、處理的巨噬細胞相比，用儲存 RBCs處理的巨噬細胞M1特異性標記表達水平更高，而表達的M2特異性標記則沒有顯著差異。上述體外結(jié)果提示：M1-極化的巨噬細胞在由儲存RBCs輸注增強細菌感染引發(fā)的肝損傷中可能發(fā)揮重要作用。
　　為了確定輸入儲存的RBCs對小鼠肝臟中Kupffer細胞的影響，對輸注儲存RBCs后小鼠肝臟中的Kupffer細胞表型標記物進行檢測。PCR實驗結(jié)果表明，儲存RBCs的輸注導致銅綠假單胞菌感染小鼠肝臟中的Kup

9、ffer細胞表型出現(xiàn)明顯變化。與新鮮RBCs組相比，來自儲存RBCs組的組織樣品iNOS、TNF-α和MCP1 mRNA水平升高，顯示儲存RBCs的體內(nèi)輸注可以促進在肝臟的Kupffer細胞朝向M1表型的極化。體內(nèi)實驗結(jié)果也證實了M1-極化的巨噬細胞的確參與儲存RBCs輸注增強細菌感染引發(fā)的肝損傷過程。
　　3.儲存的RBCs通過干擾細菌感染小鼠肝細胞內(nèi)NF-κB和JNK信號通路間的動態(tài)平衡誘導肝細胞凋亡
　　為進一步探討儲

10、存RBCs輸注增強細菌感染引發(fā)肝損傷的作用機制，本部分結(jié)合實驗室前期建立的肝臟NF-κB（nuclear factor-kappa B，核因子κB）、caspase-3可視化小鼠模型，研究儲存RBCs輸注對細菌感染小鼠肝細胞內(nèi)NF-κB和JNK（c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）信號通路間的影響。NF-κB激活對維持肝細胞存活起重要作用，通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)將pattB-NF-κB-Fluc報告基因整

11、合到小鼠肝細胞中，可以通過生物熒光成像（BLI）監(jiān)測NF-κB的動態(tài)活化。實驗數(shù)據(jù)表明，細菌感染上調(diào)小鼠肝臟NF-κB的激活，而儲存RBCs的輸注抑制了細菌感染引起的NF-κB活化。這一結(jié)果也由 EMSA（Electrophoretic mobility-shift assay，電泳遷移位移試驗）實驗進一步證實。同樣通過水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)建立帶有Caspase-3報告基因attB-ANLuc（DEVD）BCLuc的小鼠整合模型，通過BLI評

12、估caspase-3活性。實驗結(jié)果表明儲存RBCs輸注進一步增強了細菌感染引起的肝細胞JNK和caspase-3信號通路的活化。Western Blot結(jié)果顯示，與來自儲存RBCs組的肝臟樣品相比，來自新鮮RBCs組肝樣品中的p65蛋白磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果表明，NF-κB信號通路在儲存RBCs輸入的銅綠假單胞菌感染小鼠中被抑制，而JNK介導的肝細胞凋亡途徑被增強。因此，儲存的RBCs可能通過干擾NF-κB存活途徑和JNK死亡途徑

13、之間的動態(tài)平衡，進一步誘導肝損傷。
　　總之，我們的研究結(jié)果顯示儲存RBCs的輸注增強體內(nèi)細菌感染誘導的肝損傷，加劇細菌感染的嚴重程度，降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率。儲存的RBCs輸注增強促炎細胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，這些細胞因子在銅綠假單胞菌感染引發(fā)小鼠細菌感染相關(guān)的肝損傷中起重要作用。進一步研究表明，儲存RBCs促進肝損傷與M1型Kupffer細胞極化相關(guān)。M1型Kupffer細胞及其分泌的促炎細胞