儲(chǔ)存紅細(xì)胞輸注促進(jìn)細(xì)菌感染引發(fā)肝損傷及其作用機(jī)制研究.pdf

1、儲(chǔ)存紅細(xì)胞（red blood cells,RBCs）輸注能誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥、增強(qiáng)感染、引發(fā)膿毒血癥、導(dǎo)致感染性并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其具體機(jī)制尚不明確。因此，要解決儲(chǔ)存RBCs輸注誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥及增強(qiáng)感染這一臨床問題，必須加強(qiáng)對(duì)其致病機(jī)制的研究。
　　機(jī)體各重要器官，尤其是肝臟，在細(xì)菌感染的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。同時(shí)，肝臟在衰老RBCs的清除中也發(fā)揮著重要的作用，是快速清除RBCs和鐵循環(huán)的主要器官。根據(jù)肝

2、臟在細(xì)菌感染及RBCs清除中的調(diào)節(jié)活性及“儲(chǔ)存紅細(xì)胞誘導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥并增強(qiáng)感染”的理論，我們推測(cè)：儲(chǔ)存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染，可能與儲(chǔ)存RBCs輸注加重細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷密切相關(guān)。為對(duì)上述推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，本研究將基于可視化監(jiān)測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)儲(chǔ)存RBCs促進(jìn)細(xì)菌感染并引發(fā)肝損傷的作用過程，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探索。雖然Kupffer細(xì)胞與細(xì)菌感染誘導(dǎo)的肝損傷密切相關(guān)，而且儲(chǔ)存RBCs輸注與巨噬細(xì)胞之間關(guān)系也已經(jīng)被證實(shí)，但儲(chǔ)存RBCs輸注對(duì)細(xì)菌感染后肝

3、臟Kupffer細(xì)胞的影響，以及其對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響至今未見相關(guān)報(bào)道，特別是在細(xì)菌感染期間輸注儲(chǔ)存RBCs后對(duì)肝臟Kupffer細(xì)胞極化和活化的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，本研究將探討儲(chǔ)存RBCs輸注加重細(xì)菌感染并促進(jìn)肝損傷是否與Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)，并分析其引發(fā)肝損傷的分子機(jī)制，旨在了解儲(chǔ)存RBCs對(duì)肝臟損傷的調(diào)控及其對(duì)細(xì)菌感染的影響，為創(chuàng)傷患者安全輸血提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)提高臨床輸血安全性和有效性具有重要意義。

4、r>　　本研究分以下三個(gè)部分展開：
　　1.儲(chǔ)存RBCs輸注在體內(nèi)增強(qiáng)銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的肝損傷
　　首先，通過發(fā)光細(xì)菌的體外成像，證實(shí)細(xì)菌的熒光素酶活性與細(xì)菌CFU的數(shù)目成正相關(guān)。通過尾靜脈注射銅綠假單胞菌（典型的革蘭氏陰性細(xì)菌）誘導(dǎo)菌血癥建立小鼠模型，利用活體成像分析小鼠體內(nèi)的細(xì)菌感染情況。細(xì)菌的生物發(fā)光讀數(shù)與通過常規(guī)計(jì)數(shù)確定的細(xì)菌CFU數(shù)呈正相關(guān)，證明生物發(fā)光可以應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)菌增殖的變化。為了研究?jī)?chǔ)存的RBCs輸注對(duì)銅綠

5、假單胞菌誘導(dǎo)細(xì)菌感染的影響，在菌血癥小鼠模型中觀察新鮮和儲(chǔ)存 RBCs輸注后的效應(yīng)，結(jié)果表明，輸入儲(chǔ)存的RBCs可以加劇銅綠假單胞菌感染并降低小鼠的存活率。同時(shí)根據(jù)細(xì)菌體內(nèi)成像的信號(hào)顯示，感染的最初4h內(nèi)肝臟區(qū)域熒光信號(hào)最強(qiáng)，說明經(jīng)靜脈感染的銅綠假單胞菌早期主要聚集在小鼠肝臟。儲(chǔ)存RBCs輸注進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌感染小鼠血清ALT和AST的水平升高，與肝切片的組織學(xué)檢查結(jié)果一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)存RBCs的輸注促進(jìn)體內(nèi)細(xì)菌增殖，增強(qiáng)銅綠假

6、單胞菌誘導(dǎo)的肝損傷，加劇細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度。
　　2.儲(chǔ)存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷與Kupffer細(xì)胞的極化相關(guān)
　　為了確定輸注儲(chǔ)存RBCs的促炎作用，在銅綠假單胞菌感染的小鼠中監(jiān)測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6，IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。當(dāng)銅綠假單胞菌感染的小鼠輸注儲(chǔ)存的RBCs時(shí)，感染后2h血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平顯著高于輸入新鮮RBCs的小鼠。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儲(chǔ)存RBCs輸

7、注可以增強(qiáng)細(xì)菌感染的全身炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步探討這些炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生是否與巨噬細(xì)胞相關(guān)，將離體骨髓來源的巨噬細(xì)胞（bonemarrow-derived macrophage，BMDM）與儲(chǔ)存RBCs或新鮮RBCs孵育后，再加LPS刺激，結(jié)果顯示儲(chǔ)存RBCs組的上清液中IL-6和TNF-α水平顯著高于新鮮RBCs組，表明與儲(chǔ)存RBCs的孵育顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定F4/80+巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)記物，結(jié)果表明：與用新鮮RBCs

8、處理的巨噬細(xì)胞相比，用儲(chǔ)存 RBCs處理的巨噬細(xì)胞M1特異性標(biāo)記表達(dá)水平更高，而表達(dá)的M2特異性標(biāo)記則沒有顯著差異。上述體外結(jié)果提示：M1-極化的巨噬細(xì)胞在由儲(chǔ)存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷中可能發(fā)揮重要作用。
　　為了確定輸入儲(chǔ)存的RBCs對(duì)小鼠肝臟中Kupffer細(xì)胞的影響，對(duì)輸注儲(chǔ)存RBCs后小鼠肝臟中的Kupffer細(xì)胞表型標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)存RBCs的輸注導(dǎo)致銅綠假單胞菌感染小鼠肝臟中的Kup

9、ffer細(xì)胞表型出現(xiàn)明顯變化。與新鮮RBCs組相比，來自儲(chǔ)存RBCs組的組織樣品iNOS、TNF-α和MCP1 mRNA水平升高，顯示儲(chǔ)存RBCs的體內(nèi)輸注可以促進(jìn)在肝臟的Kupffer細(xì)胞朝向M1表型的極化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了M1-極化的巨噬細(xì)胞的確參與儲(chǔ)存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)的肝損傷過程。
　　3.儲(chǔ)存的RBCs通過干擾細(xì)菌感染小鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JNK信號(hào)通路間的動(dòng)態(tài)平衡誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡
　　為進(jìn)一步探討儲(chǔ)

10、存RBCs輸注增強(qiáng)細(xì)菌感染引發(fā)肝損傷的作用機(jī)制，本部分結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期建立的肝臟NF-κB（nuclear factor-kappa B，核因子κB）、caspase-3可視化小鼠模型，研究?jī)?chǔ)存RBCs輸注對(duì)細(xì)菌感染小鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB和JNK（c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）信號(hào)通路間的影響。NF-κB激活對(duì)維持肝細(xì)胞存活起重要作用，通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)將pattB-NF-κB-Fluc報(bào)告基因整

11、合到小鼠肝細(xì)胞中，可以通過生物熒光成像（BLI）監(jiān)測(cè)NF-κB的動(dòng)態(tài)活化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌感染上調(diào)小鼠肝臟NF-κB的激活，而儲(chǔ)存RBCs的輸注抑制了細(xì)菌感染引起的NF-κB活化。這一結(jié)果也由 EMSA（Electrophoretic mobility-shift assay，電泳遷移位移試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。同樣通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)建立帶有Caspase-3報(bào)告基因attB-ANLuc（DEVD）BCLuc的小鼠整合模型，通過BLI評(píng)

12、估caspase-3活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儲(chǔ)存RBCs輸注進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)菌感染引起的肝細(xì)胞JNK和caspase-3信號(hào)通路的活化。Western Blot結(jié)果顯示，與來自儲(chǔ)存RBCs組的肝臟樣品相比，來自新鮮RBCs組肝樣品中的p65蛋白磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果表明，NF-κB信號(hào)通路在儲(chǔ)存RBCs輸入的銅綠假單胞菌感染小鼠中被抑制，而JNK介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡途徑被增強(qiáng)。因此，儲(chǔ)存的RBCs可能通過干擾NF-κB存活途徑和JNK死亡途徑

13、之間的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)一步誘導(dǎo)肝損傷。
　　總之，我們的研究結(jié)果顯示儲(chǔ)存RBCs的輸注增強(qiáng)體內(nèi)細(xì)菌感染誘導(dǎo)的肝損傷，加劇細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度，降低銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率。儲(chǔ)存的RBCs輸注增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子在銅綠假單胞菌感染引發(fā)小鼠細(xì)菌感染相關(guān)的肝損傷中起重要作用。進(jìn)一步研究表明，儲(chǔ)存RBCs促進(jìn)肝損傷與M1型Kupffer細(xì)胞極化相關(guān)。M1型Kupffer細(xì)胞及其分泌的促炎細(xì)胞