實(shí)驗(yàn)性急性肺損傷肺修復(fù)策略與生命支持的研究.pdf

1、第一部分 小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn) 研究背景：骨髓干細(xì)胞移植修復(fù)肺損傷是近年來的研究熱點(diǎn)。本研究將BMSCs移植入致死劑量全身照射(TBI)小鼠體內(nèi)，觀察在合并內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)肺部炎癥損傷的情況下供體來源的BMSCs向肺泡上皮細(xì)胞分化的狀況，為肺損傷修復(fù)探索新的方法。 目的： 1．體外分離培養(yǎng)BMSCs并鑒定其生物學(xué)性狀。 2．建立LPS誘導(dǎo)肺部炎癥損傷模型和BMSCs移植造血重建模型

2、。 3．觀察BMSCs移植后能否向肺部遷移、分化成肺泡上皮細(xì)胞，及細(xì)胞移植效率，供體來源細(xì)胞是否參與了受損肺泡上皮的修復(fù)。 方法： 1．利用全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs，行CD34、CD59和CD90.1免疫細(xì)胞熒光染色以分析其生物學(xué)特性，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞、神經(jīng)元分化以確定多向分化潛能。 2．氣道內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)肺部炎癥損傷模型，檢測肺泡灌洗液中總蛋白(TP)、WBC計(jì)數(shù)和肺病理形態(tài)。 3．致死劑量

3、TBI后移植BMSCs，檢測移植后外周血常規(guī)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺、肝、脾病理形態(tài)變化，以確定有無造血重建。 4．將綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs向 TBI小鼠移植，7天、14天后進(jìn)行GFP和肺泡上皮標(biāo)記物CK5&8免疫熒光雙標(biāo)染色，并用流式細(xì)胞儀檢測受體小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 (AECⅡ)GFP陽性率，和肺組織SP-A、SP-C、AQP5 mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1．全骨髓貼壁分離培養(yǎng)BMSCs有良好

4、的增殖能力，CD34表達(dá)陰性，經(jīng)體外定向向成骨細(xì)胞分化，AKP表達(dá)增強(qiáng)，茜素紅染色陽性；向神經(jīng)元分化后MAP-2免疫細(xì)胞熒光染色陽性。 2．氣道內(nèi)滴入LPS后第1天，肺泡灌洗液TP和WBC計(jì)數(shù)達(dá)高峰，伴顯著的肺炎癥損傷病理改變，以后TP和WBC逐漸下降，肺病理損害逐漸減輕。 3．TBI后外周血和骨髓有核細(xì)胞在7天內(nèi)降至最低點(diǎn)，未移植組小鼠在10天全部死于造血衰竭，移植BMSCs小鼠生存率為60-70％，外周血WBC、Pt

5、、Hb 和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸回升。TBI后第3天有肺部輕度病理改變，合并LPS誘導(dǎo)肺炎癥損傷時病變更重，但隨后病變逐漸減輕，至第28天基本無病理改變。 4．TBI和合并肺炎癥損傷的TBI小鼠以GFP陽性BMSCs移植后第14天，免疫熒光雙標(biāo)染色檢測到GFP和CK5&8雙染陽性細(xì)胞，AECⅡGFP陽性率高于對照組，合并肺炎癥損傷的TBI小鼠SP-C mRNA表達(dá)增加。 結(jié)論： 用全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)小鼠BMS

6、Cs，所培養(yǎng)細(xì)胞具有多向分化能力。建立LPS誘導(dǎo)小鼠肺炎癥損傷模型和TBI后BMSCs移植造血重建模型，在移植后第14天，約10％AECⅡ來源于供體細(xì)胞，參與肺泡上皮的修復(fù)。當(dāng)合并LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥損傷時，供體來源細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞的分化有增加的趨勢。 第二部分 體外膜肺救治油酸致急性呼吸窘迫綜合征的實(shí)驗(yàn) 研究背景：ARDS是危及各個年齡層的危重疾病，我國小兒ARDS病死率高達(dá)62.9％，有必要探索新的治療策略。ECM

7、O作為一項(xiàng)新的生命支持技術(shù)，它的本質(zhì)是一種改良的人工心肺機(jī)，對嚴(yán)重呼吸循環(huán)功能衰竭的患者提供較長時間的生命支持，當(dāng)常規(guī)方法治療 ARDS 均無改善時，ECMO可作為最終的救治手段。盡管在國外ECMO已臨床應(yīng)用三十余年，但我國尚處于起步階段，應(yīng)用ECMO治療小兒呼吸衰竭尚無臨床報(bào)道，動物實(shí)驗(yàn)的研究資料也很有限。本實(shí)驗(yàn)擬建立油酸誘導(dǎo)ARDS模型，探討ECMO救治幼年動物ARDS的有效性和安全性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的：

8、 1．建立ECMO在健康和油酸誘導(dǎo)ARDS幼豬穩(wěn)定轉(zhuǎn)流模型。 2．從呼吸力學(xué)、氣體交換、血流動力學(xué)、重要臟器病理形態(tài)、腦氧合和灌注、炎癥反應(yīng)和內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生等方面，探討ECMO的安全性和救治幼豬ARDS的有效性。 方法： 19頭5-6周齡、9-14 kg幼豬經(jīng)鎮(zhèn)靜麻醉后給予氣管插管、常規(guī)機(jī)械通氣，穩(wěn)定30分鐘后應(yīng)用油酸經(jīng)中心靜脈誘導(dǎo)產(chǎn)生ARDS模型。分離右股動脈和左頸外靜脈，分別置Picco動脈導(dǎo)管和漂浮導(dǎo)

9、管，監(jiān)測血流動力學(xué)；分離右頸外靜脈和右股靜脈，分別置靜脈導(dǎo)管，作為ECMO轉(zhuǎn)流的引血端和回血端。將動物隨機(jī)分為4組：CON 組(n=5)，單純機(jī)械通氣24小時；ECMO組(n=6)，以ECMO轉(zhuǎn)流24小時后停轉(zhuǎn)觀察6小時；ARDS組(n=5)，油酸誘導(dǎo)ARDS后單純機(jī)械通氣治療；AEC組(n=5)：油酸誘導(dǎo)ARDS后以機(jī)械通氣和ECMO治療24小時，再停轉(zhuǎn)觀察6小時。在基礎(chǔ)狀態(tài)(Base)、成模時(0h)、以后每小時監(jiān)測呼吸力學(xué)、氣體交

10、換、血流動力學(xué)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取肺泡灌洗液檢測總蛋白(TP)、磷脂含量、磷脂表面張力，檢測肺組織濕干重比(W/D)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、炎癥因子(TNFα，IL-1β，IL-6，IL-8)mRNA表達(dá)，取肺、肝、腸、腎、大腦海馬送檢病理形態(tài)，檢測肺組織和心肌組織細(xì)胞凋亡，以近紅外光譜儀(NIRS)監(jiān)測腦氧合和腦灌注。為評價(jià)ECMO對內(nèi)源性一氧化氮(NO)產(chǎn)生的影響，檢測肺泡灌洗液和血清不同時點(diǎn)NO<,2><'->

11、/NO<,3><'->含量，肺組織總一氧化氮合酶(tNOS)活性，誘生型和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(iNOS，eNOS) mRNA表達(dá)和肺組織內(nèi)分布。 結(jié)果： 1．ARDS模型的建立：油酸注射后4-6小時內(nèi)可誘導(dǎo)出ARDS模型，成模時PaO<,2>/FiO<,2><200 mmHg，動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)較基礎(chǔ)狀態(tài)下降50％以上。病理表現(xiàn)為彌漫性炎性細(xì)胞浸潤、肺水腫及嚴(yán)重肺泡萎陷、出血等病理表現(xiàn)。 2．生存率：至實(shí)驗(yàn)結(jié)

12、束CON組和ECMO組全部存活，AEC組1只動物在轉(zhuǎn)流22 h死亡，ARDS組動物于成模后14-24 h之間死亡。 3．ECMO系統(tǒng)管理：ECMO轉(zhuǎn)流期間血流量70-80 ml/kg，全程維持活化凝血時間(ACT)180-220 s，SvO<,2> 68-75％之間。 4．血流動力學(xué)：隨著實(shí)驗(yàn)時間的延長，ECMO組心輸出量(CO)有上升趨勢，外周血管阻力(SVR)呈下降趨勢；與ARDS組比較，AEC組平均動脈壓(MABP

13、)、CO、SVR均有一定的程度的改善。 5．呼吸力學(xué)：各組Cdyn均下降，ECMO組16 h、24 h和Post點(diǎn)與Base比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在0 h點(diǎn)，ARDS組和AEC組Vd/Vt與Base比較顯著增高(P<0.05)，以后 ARDS組Vd/Vt進(jìn)一步升高，而AEC組有下降趨勢。AEC組PaCO<,2>在0 h點(diǎn)較Base顯著升高(P<0.01)，但ECMO轉(zhuǎn)流后PaCO<,2>下降至正常范圍，與同時點(diǎn)C

14、ON組比較差異無顯著性意義。 6．氣體交換：ARDS組和AEC組成模后P/F顯著下降，隨后ARDS組P/F進(jìn)一步下降，而AEC組在ECMO啟動后P/F比值升高。CON組和ECMO組P/F 隨著實(shí)驗(yàn)時間延長，均有下降趨勢。ARDS組和AEC組肺泡-動脈氧分壓差(A-aDO<,2>)、氧合指數(shù)(OI)、通氣指數(shù)(Ⅵ)、肺內(nèi)分流(Qs/Qt)變化趨勢與P/F值相反，即隨著ECMO啟動，AEC組各指標(biāo)均有一定程度的下降。ECMO組DO<

15、,2>在各時點(diǎn)均有高于其他組的趨勢。 7．血常規(guī)及血液生化：成模后ARDS組和AEC組WBC均有下降趨勢。隨著轉(zhuǎn)流時間的延長，ECMO組和AEC組Hb和Hct均有下降趨勢，但組內(nèi)及組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生化指標(biāo)各組內(nèi)及組間均無顯著差異。 8．磷脂含量及表面張力：與CON組比較，ARDS組和AEC組總磷脂(TPL)下降，最小表面張力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ECMO組與CON組比較，TPL、DSPC/T

16、PL 和表面張力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 9．炎癥損傷：與CON組比較，ARDS組和AEC組TP升高，DSPC/TP下降，W/D和MPO增高，IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AEC組與ARDS組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ECMO組與CON組比較，除DSPC/TP外，其余指標(biāo)無均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 10．病理形態(tài)：與CON組比較，ECMO組肺、心、肝、腸、腎、大腦海馬均有輕度病理損傷；與

17、ARDS組比較，AEC組肺、腸病理損傷減輕，心、肝、腎、大腦海馬病理變化相似。 11．腦氧合和灌注：各組組內(nèi)及組間比較，以NIRS監(jiān)測腦氧合和腦灌注均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 12．內(nèi)源性NO：轉(zhuǎn)流啟動后，ECMO組和AEC組NO<,2><'->/NO<,3><'->含量下降，ECMO組肺組織eNOS mRNA表達(dá)低于其他三組，eNOS蛋白表達(dá)減少。 結(jié)論： 成功復(fù)制油酸誘導(dǎo)幼豬ARDS模型，建立健康幼豬和ARDS