術(shù)后腹腔細(xì)菌感染對(duì)原位肝移植大鼠細(xì)胞免疫功能的影響及胸腺肽α1的作用.pdf

1、目的：建立近郊系大鼠原位肝移植術(shù)后腹腔細(xì)菌感染模型，研究細(xì)菌感染對(duì)移植肝急性排斥反應(yīng)的影響，進(jìn)而研究其對(duì)受體T細(xì)胞免疫功能的影響及脾臟DCs的增殖情況和其生物學(xué)效應(yīng)，并探討胸腺肽α1對(duì)其的免疫調(diào)理作用。
　　 方法：⑴建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型：分3種移植組合：SD→SD組(同基因?qū)φ战M)，SD→Wistar組及DA→Lewis組，每組32例。分別于術(shù)后3、5、7、10天各隨機(jī)處死4只，觀察外周血肝功能變化(ALT和TB

2、IL)與肝臟病理改變，將余大鼠留作生存分析。⑵建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型并留置腹腔導(dǎo)管，于術(shù)后3天、5天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)灌注ATCC25922大腸桿菌活菌，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為5個(gè)感染組：2×108cfu/ml、2×107cfu/ml、5×106cfu/ml、1×106cfu/ml、5×105cfu/ml，1個(gè)對(duì)照組：腹腔灌注滅菌生理鹽水2ml。于灌注前1d、灌注后1d、3d、5d、7d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只大鼠，另設(shè)8只大鼠觀察感染

3、后一般情況及生存時(shí)間。觀察受體一般情況、腹水細(xì)菌培養(yǎng)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、TCO2、HCO3-、PH、ALT、TB以及肝腎肺HE染色，評(píng)價(jià)感染的狀態(tài)及嚴(yán)重程度。⑶以DA或LEW大鼠為供體，LEW大鼠為受體，建立大鼠肝移植模型，根據(jù)有無誘導(dǎo)感染分為4組：G1組為LEW→LEW，無感染組；G2組為LEW→LEW，感染組；G3組為DA→LEW，無感染組；G4組為DA→LEW，感染組。注菌時(shí)間為術(shù)后第三天，濃度1×106cfu/mL。

4、每組于感染前1d、感染后1、3、5d，即術(shù)后第2、4、6、8d，共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只大鼠。通過觀察肝臟病理改變、免疫組化法及熒光定量PCR檢測移植肝內(nèi)CXCR3、CXCL10變化及TUNEL法檢測肝臟淋巴細(xì)胞凋亡情況，評(píng)價(jià)細(xì)菌感染對(duì)移植肝免疫排斥反應(yīng)的影響。⑷以DA大鼠為供體，LEW大鼠為受體，建立大鼠肝移植模型，根據(jù)有無誘導(dǎo)感染和/或藥物干預(yù)分為4組：G1組為移植對(duì)照組；G2組在G1組基礎(chǔ)上藥物干預(yù)；G3組為感染組；G4組感染

5、后藥物干預(yù)組。感染誘導(dǎo)方法同步驟4，胸腺肽α1一次性2mg于術(shù)后6天或感染后72h注入腹腔。每組于感染前1d、胸腺肽α1處理后2d，即術(shù)后第8d，共2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只大鼠，每組另設(shè)6只大鼠觀察生存期。觀察大鼠一般情況、生存期、移植肝病理變化、外周血T細(xì)胞亞群比例及功能變化，探討免疫調(diào)理對(duì)大鼠肝移植術(shù)后腹腔感染的治療作用。⑸統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、生存分析等，P＜0.05判定為有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①SD→SD組均生存超過120d；SD→Wistar組中位生存時(shí)間為100d，95％可信區(qū)間為(83.369～116.631)d；兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.317)，DA→Lewis組中位生存時(shí)間為12d，95％可信區(qū)間為(10.125～13.848)d，生存時(shí)間明顯較SD→Wistar組縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。SD→SD組血清ALT、TBIL濃度術(shù)后隨時(shí)間的延長，逐漸下降，肝功能好

7、轉(zhuǎn)；SD→Wistar組血清ALT、TBIL濃度隨時(shí)間延長，于術(shù)后5d下降相對(duì)較慢，隨后逐步下降；DA→Lewis組血清ALT、TBIL濃度術(shù)后隨時(shí)間的延長，呈進(jìn)行性升高。至術(shù)后10d，ALT：SD-SD＜SD-Wistar＜DA-Lewis(58.38±12.44 vs100.96±16.50 vs1162.25±84.34)：TBIL：SD-SD＜SD-Wistar＜DA-Lewis(15.99±5.92 vs76.65±9.45

8、vs175.06±16.67，兩者比較，DA→Lewis組與其它兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SD→SD組移植肝未見急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)，RAI評(píng)分多數(shù)為1、2分；SD→Wistar組術(shù)后10d時(shí)RAI評(píng)分多數(shù)為1、2分；DA→Lewis組術(shù)后3d后移植肝急性排斥反應(yīng)開始出現(xiàn)，之后均迅速加重，術(shù)后5d達(dá)輕～中度，術(shù)后7d達(dá)中～重度，術(shù)后10d全部受體移植肝RAI評(píng)分在8～9分。術(shù)后10d時(shí)，RAI評(píng)分Kruskal-Wallis

9、H檢驗(yàn)x2=20.107，v=2，P=0.000，3組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②HE結(jié)果顯示，感染后第5d(術(shù)后第8d)，G3組4只大鼠病理表現(xiàn)均呈重度急性排斥反應(yīng)，G4組僅有1只受體大鼠移植肝呈重度急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)，而肝實(shí)質(zhì)損害加重，RAI評(píng)為為(8.0±0.8 vs6.5±1.3，P＜0.05)。CXCL-10及其配體CXCR-3免疫組化結(jié)果及mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量，G3組呈持續(xù)上升趨勢；而G4組觀察時(shí)間內(nèi)早中期升高，感染后5d下降

10、，此時(shí)與G3組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組移植肝內(nèi)凋亡細(xì)胞均持續(xù)增多，但G3組凋亡細(xì)胞主要分布在肝實(shí)質(zhì)，隨時(shí)間推移，匯管區(qū)凋亡細(xì)胞增多；G4組凋亡細(xì)胞主要分布在肝實(shí)質(zhì)，隨感染加重，匯管區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增多，術(shù)后8d與G3組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：G1組T淋巴細(xì)胞功能術(shù)后輕度升高，G2組淋巴細(xì)胞功能呈上升趨勢，G3組淋巴細(xì)胞功能明顯升高，G4組淋巴細(xì)胞功能持續(xù)升高，G2、G4組淋巴

11、細(xì)胞功能上升幅度均不及G3組，且在感染后上升趨勢明顯變緩。G1、G2、G3組術(shù)后第8d淋巴細(xì)胞功能比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.3727±0.05479 vs0.7795±0.00995 vs0.9550±0.03594，P＜0.05)，G4組感染后第5d(術(shù)后第8d)，淋巴細(xì)胞功能低于G3組(0.7560±0.00787 vs0.9550±0.03594，P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：G1組T淋巴細(xì)胞亞群及其比值均變化不大；G2組

12、感染后5d，T細(xì)胞亞群比值降低；G3組CD4+和CD8+T細(xì)胞在術(shù)后前三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有所下降，至術(shù)后8d方回升，CD8+/CD4+T細(xì)胞改變升高，與術(shù)后2d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；G4組隨著感染的加重，CD4+和CD8+T細(xì)胞均較快下降，兩者比值亦持續(xù)下降，至感染后5d，其比值在1.43～1.46之間，較之感染前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。感染后5d(術(shù)后8d)，三者差異G4組與G1、G3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外周血IL

13、-10水平的變化：G1組術(shù)后比較穩(wěn)定，變化不大，G2組感染后呈低水平升高；G3組術(shù)后持續(xù)降低；G4組感染后持續(xù)顯著升高；術(shù)后第8d，G3＜G1＜G2＜G4，兩兩之間比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。外周血IFN-γ水平的變化：在G1組維持變化不大；G3組于術(shù)后明顯升高，與急性排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間同步；G2組術(shù)后感染后早中期升高，感染后期術(shù)后第8d顯著下降，與感染后第3d比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；相同情況也發(fā)生在

14、G4組；感染后第5d(術(shù)后第8d)，各組兩兩之間比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。外周血IL-12的表達(dá)水平：G1組改變不明顯；G3組術(shù)后持續(xù)上升；G2組先升高，至感染后5d后下降；G4組表現(xiàn)與G2組類似，但感染后5d下降比例明顯大于G2組。感染后第5d(術(shù)后第8d)，各組兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。④G1組與G2組中位生存時(shí)間均為12d，95％CI分別為(10.400～13.600)和(10.868～13

15、.132)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.416)；G3組與G4中位生存時(shí)間分別為9d和10d，95％CI分別為(7.400～10.600)和(8.868～11.132)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.671)。至觀察終點(diǎn)，G1、G2組RAI評(píng)分均為8～9分，屬于重度急性排斥反應(yīng)；G3、G4組術(shù)后第8d移植肝RAI評(píng)分6～8分，介于中到重度排斥反應(yīng)之間；G1與G2、G3與G4組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。處理后，G2

16、組、G4組淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及比值均升高，T淋巴細(xì)胞功能升高，G2組與G1組及G4組與G3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的封閉群大鼠原位肝移植模型，手術(shù)時(shí)間短、成功率高、穩(wěn)定可靠。在此基礎(chǔ)上，成功建立了穩(wěn)定的近交系大鼠原位肝移植急性排斥模型，結(jié)果穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。⑵隨著感染加重，一定程度上加重了肝實(shí)質(zhì)損害，但部分緩解了肝移植排斥反應(yīng)病理表現(xiàn)程度。趨化因子C

17、XCL-10及其受體CXCR-3在感染后期表達(dá)減少以及移植肝匯管區(qū)及小葉中央靜脈周圍浸潤淋巴細(xì)胞凋亡增多是移植肝排斥反應(yīng)減輕的原因之一。⑶排斥反應(yīng)和感染早期T淋巴細(xì)胞功能均增加，移植術(shù)后感染后期淋巴細(xì)胞功能嚴(yán)重降低；排斥反應(yīng)使機(jī)體CD4+/CD8+T細(xì)胞比值升高；感染使CD4+/CD8+比值早期增加，晚期降低，二者的協(xié)同作用則使CD4+/CD8+T細(xì)胞比值顯著下降。排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，血清IFN-γ水平升高；感染作用下，IL-10水平升高；

18、兩者共同作用下，促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)變。機(jī)體抗炎反應(yīng)占優(yōu)勢，表現(xiàn)為一種局部和全身免疫抑制狀態(tài)。⑷細(xì)菌感染早期或急性免疫排斥反應(yīng)均可促進(jìn)脾臟DCs快速成熟，促進(jìn)其刺激同種異體T細(xì)胞增殖的功能；至感染后期，尤其是排斥反應(yīng)和感染同時(shí)作用時(shí)，DCs表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，刺激同種異體T細(xì)胞增殖的功能明顯下降。⑸大鼠肝移植術(shù)后合并腹腔細(xì)菌感染，短時(shí)間內(nèi)，給予免疫調(diào)理治療未明顯延長受體生存時(shí)間，但亦未發(fā)現(xiàn)加重移植肝急性排斥反應(yīng)的程度，卻能提高肝移