骨髓基質細胞與MPEG-PLLA-PLL聚合膜的黏附機制研究.pdf

1、牙周炎導致的牙周骨的缺損是口腔臨床亟需解決的問題，組織工程技術的應用為牙周骨缺損修復帶來希望。組織工程包括種子細胞、支架材料和生長因子三大要素。種子細胞與支架材料的黏附是二者相互作用的第一步，在體內(nèi)，細胞的黏附活動受到細胞表面的整合素等細胞黏附分子及存在于胞外基質中的黏附蛋白的調(diào)節(jié)；在體外，細胞的黏附受到胞外環(huán)境的影響，尤其是生物支架材料表面的性能的影響。深入了解在細胞黏附過程中，黏附分子的參與調(diào)節(jié)及其作用，對生物材料表面進行修飾和改性

2、，有效地提高細胞對材料的黏附能力，促進細胞的增殖和誘導細胞的分化，是組織工程生物支架材料面臨的挑戰(zhàn)。
　　 本課題擬對骨髓基質細胞進行培養(yǎng)和富集，采用掃描電鏡及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察BMSCs對改性材料表面黏附過程中的形態(tài)學變化，利用基因分析技術探討B(tài)MSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附的基因調(diào)控機制，對細胞與材料整合過程中黏附分子之間的調(diào)控作用進行系統(tǒng)深入的研究；并對基因分析中差異表達的基因進行功能分析，篩選出對初

3、始黏附活動起重要作用的基因，闡明BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜初始黏附過程的分子機制，為促進細胞黏附的新材料的研制和牙體牙周組織再生提供實驗依據(jù)。
　　 第一章 MPEG和PLL對BMSCs初始黏附中的作用
　　 目的：通過觀察BMSCs對MPEG-PLLA和PLLA-PLL兩種聚合膜表面的黏附，探討表面改性基團MPEG和PLL對BMSCs黏附行為的影響。
　　 方法：取第2-6代原代培養(yǎng)BMSCs

4、，接種至PLLA、MPEG-PLLA和PLLA-PLL三種聚合膜和TCP(組織細胞培養(yǎng)板)表面，分別在DMEM和10％FBS DMEM兩種不同條件下連續(xù)培養(yǎng)1小時，定量檢測黏附細胞；分別對培養(yǎng)1小時、2小時和24小時的細胞進行掃描電鏡觀察；對培養(yǎng)1小時和24小時的細胞進行細胞骨架蛋白染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。
　　 結果：黏附細胞定量檢測結果顯示，與TCP比較，DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA和PLLA-PLL兩組聚

5、合膜細胞黏附量均增高；10％ FBS DMEM培養(yǎng)條件下，兩組聚合膜細胞黏附量均降低。與PLLA比較，DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA聚合膜細胞黏附量增高，MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA56聚合膜組份細胞黏附量明顯增高；10％ FBS DMEM培養(yǎng)條件下，MPEG-PLLA聚合膜細胞黏附量無明顯改變。在兩種培養(yǎng)條件下，與PLLA比較，PLLA-PLL聚合膜細胞黏附量均隨改性基團PLL含量升高而增高，PLLA77

6、-PLLA72聚合膜組分明顯增高，當PLL增高到一定程度(PLLA160-PLL245)，細胞黏附量下降。
　　 掃描電鏡結果顯示，連續(xù)培養(yǎng)1小時，PLLA聚合膜上細胞胞體小，形態(tài)呈球形，伸出大量細長的偽足，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細胞呈圓餅狀，細胞邊緣較厚，TCP表面的細胞扁平舒展，細胞邊緣與材料貼附；連續(xù)培養(yǎng)2小時，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細胞胞體增大，并向聚合膜表面伸出較多偽足。連續(xù)

7、培養(yǎng)24小時，細胞移行伸展成梭形，各材料表面細胞形態(tài)接近。
　　 激光共聚焦掃描電鏡觀察結果顯示，連續(xù)培養(yǎng)1小時，PLLA聚合膜上細胞骨架蛋白成環(huán)狀分布于細胞邊緣，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細胞骨架蛋白成點狀、環(huán)狀或細絲狀貫穿分布與胞漿中；連續(xù)培養(yǎng)24小時，PLLA聚合膜上細胞骨架蛋白分布稀疏，MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細胞骨架蛋白大量表達，排列有序。
　　 結論：改性基團MPEG和P

8、LL能直接促進BMSCs的黏附：MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜促進BMSCs的黏附；細胞形態(tài)學結果進一步證實了這一結論。
　　 第二章 MPEG-PLLA-PLL表面改性聚合膜對BMSCs初始黏附的影響
　　 目的：通過對MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面BMSCs黏附情況的觀察和聚合膜蛋白吸附定量分析，初步探討MPEG-PLLA-PLL對BMSCs初始黏附的影響和作用機制。
　　 方法：取第2-6

9、代原代培養(yǎng)BMSCs，接種至PLLA、MPEG-PLLA和四組MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面，分別在DMEM和10％ FBS DMEM兩種不同培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)1小時，定量檢測黏附細胞總數(shù)；分別對連續(xù)培養(yǎng)1小時、2小時和24小時的細胞進行掃描電鏡觀察及細胞面積定量分析；連續(xù)培養(yǎng)1小時和24小時后，細胞骨架蛋白染色，激光共聚焦顯微鏡觀察；全血清孵育聚合膜24小時，定量檢測材料表面吸附的血清蛋白。
　　 結果：對四組改性基團比

10、例不同的MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附細胞定量檢測發(fā)現(xiàn)，與PLLA比較，在DMEM和10％ FBS DMEM兩種培養(yǎng)條件下，四組聚合膜中MPEG-PLLA-PLL聚合膜細胞黏附量增高；同組聚合膜內(nèi)，細胞黏附量均隨著PLL含量的升高而增高，當PLL增高至一定程度時，細胞黏附量下降。與TCP比較，在兩種培養(yǎng)條件下，MPEG17PLLA94PLL107和MPEG17PLLA160PLL162聚合膜組份細胞黏附量均高于TCP。
　　

11、 掃描電鏡結果顯示，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面，細胞扁平舒展，大量膜狀扁平偽足從細胞邊緣伸出，PLLA聚合膜上細胞呈球形，大量細長指突狀偽足從細胞邊緣伸出。面積定量分析結果表明，MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP上細胞舒展面積大于PLLA，差異有統(tǒng)計學意義。MPEG-PLLA和PLLA-PLL聚合膜上細胞面積的變化與PLLA比較無統(tǒng)計學差異。
　　 激光共聚焦掃描顯微鏡結果顯示，細胞連續(xù)培養(yǎng)1小時，MP

12、EG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表向細胞骨架蛋白表達豐富，排列清晰；PLLA聚合膜表面細胞骨架蛋白呈環(huán)狀或點狀，不均勻分布于細胞邊緣及胞漿中；連續(xù)培養(yǎng)24小時，MPEG-PLLA-PLL和TCP表面細胞骨架蛋白表達豐富，排列清晰有序，大量骨架蛋白絲越過細胞核貫穿整個細胞；PLLA表面，骨架蛋白主要分布于細胞邊緣，表達稀疏。
　　 蛋白吸附定量分析結果顯示，與空白對照比較MPEG-PLLA-PLL聚合膜血清蛋白吸附量無明顯變化

13、，PLLA和MPEG-PLL兩種聚合膜上血清蛋白吸附量升高。
　　 結論：MPEG-PLLA-PLL聚合膜不受培養(yǎng)環(huán)境中血清的影響，能促進BMSCs的黏附；MPEG-PLLA-PLL聚合膜通過降低培養(yǎng)環(huán)境中非特異性蛋白的吸附促進BMSCs的黏附。
　　 第三章 MPEG-PLLA-PLL聚合膜細胞毒性實驗
　　 目的：通過對成骨細胞在聚合膜表面生長情況的觀察及細胞膜完整性的檢測，探討聚合膜體外細胞毒性。
　

14、　 方法：取第6-8代體外培養(yǎng)的成骨細胞，接種至PLLA、MPEG-PLLA、MPEG-PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL+Br等聚合膜和TCP表面，連續(xù)培養(yǎng)24小時，檢測培養(yǎng)基中LDH的濃度，判斷細胞膜的完整性；連續(xù)培養(yǎng)3天和7天，對聚合膜表面的成骨細胞進行結晶紫染色，倒置相差顯微鏡觀察。
　　 結果：LDH檢測結果顯示，PLLA、MPEG-PLLA和MPEG-PLLA-PLL聚合膜細胞培養(yǎng)上清與TCP比較，OD值

15、無明顯變化(p>0.05)；MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜細胞培養(yǎng)上清OD值明顯增高(p<0.05)。分別連續(xù)培養(yǎng)3天和7天，結晶紫染色顯示PLLA、MPEG-PLLA、PLLA-PLL、MPEG-PLLA-PLL聚合膜和TCP表面細胞大量生長，MPEG-PLLA-PLL+Br聚合膜僅殘留細胞殘片。
　　 結論：經(jīng)過對PLLA，MPEG-PLLA，PLLA-PLL和MPEG-PLLA-PLL聚合膜體外實驗未顯示聚合膜細胞

16、毒性。
　　 第四章BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附機制基因分析
　　 目的：通過對BMSCs與MPEG-PLLA-PLL聚合膜黏附過程中，相關黏附基因表達分析，探討MPEG-PLLA-PLL聚合膜對BMSCs黏附過程中的影響機制。
　　 方法：取第2-4代原代培養(yǎng)BMSCs，接種至PLLA、MPEG17-PLLA94和MPEG17-PLLA94-PLL107聚合膜和TCP表面連續(xù)培養(yǎng)24小時，收

17、集各聚合膜和TCP上黏附的細胞，提取總RNA，利用SuperArray RT2 PCR試劑盒，采用Reversetranscription PCR及Realtime PCR技術，對與細胞初始黏附相關的84個黏附基因的表達情況進行定量分析。
　　 結果：通過對MPEG-PLLA-PLL/PLLA、 MPEG-PLLA-PLL/TCP、MPEG-PLLA/PLLA、MPEG-PLLA/TCP、MPEG-PLLA/MPEG-PLLA-

18、PLLA、PLLA/TCP每兩種材料表面細胞黏附基因表達進行對比分析發(fā)現(xiàn)，共有26個基因改變有統(tǒng)計學意義，與PLLA聚合膜和TCP比較，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面10個基因表達上調(diào)，2個基因表達下調(diào)：與MPEG-PLL聚合膜比較，MPEG-PLLA-PLL聚合膜表面6個基因表達上調(diào)，1個基因表達下調(diào)。變化活躍的基因有CDH1、COL16A1、ITGB2、ITGAL、ITGAM、LAMA1、LAMA3、MMP3、MMP7、MMP