新型炔酚類化合物selaginellin抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老及神經(jīng)生物學(xué)功能研究.pdf

1、第一章 Selaginellin抑制同型半胱氨酸所致血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老及機(jī)制研究
　　 研究背景：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性、進(jìn)行性、多發(fā)性血管內(nèi)膜疾病,嚴(yán)重危害人類的健康。AS發(fā)病原因及機(jī)制十分復(fù)雜,目前認(rèn)為與血脂、吸煙、高血壓、糖尿病、肥胖、感染等危險因素密切相關(guān)。大量研究證明,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)也是促進(jìn)AS形成的重要因素。Hcy能促進(jìn)動脈粥樣斑

2、塊形成,增加冠心病患者的病死率,被認(rèn)為是AS的獨(dú)立危險因素。
　　 衰老是AS發(fā)生發(fā)展的重要危險因素之一。年齡相關(guān)的血管疾病的很多改變都與衰老血管細(xì)胞的特征性改變相一致。內(nèi)皮功能紊亂引起血管收縮異常、血小板粘附聚集以及動脈中膜平滑肌增生,被認(rèn)為是AS發(fā)病的始發(fā)事件。因此,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,拮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老是防治心血管病特別是動脈粥樣硬化的重要研究方向。
　　 大量研究表明與衰老密切相關(guān)的Sirtl基因在維持血管內(nèi)皮功能方

3、面發(fā)揮重要作用。Sirtl是近幾年發(fā)現(xiàn)的抗衰老長壽基因,參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老。研究顯示,Hcy致AS作用與其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老有關(guān)。
　　 卷柏屬于蕨類卷柏科卷柏屬植物,具有降血壓、降血糖、增強(qiáng)人體免疫功能和抑制氧化應(yīng)激等作用。Selaginellin是從卷柏中提取的一種具有全新結(jié)構(gòu)的單體化合物,體外抗氧化實驗結(jié)果顯示,selaginellin具有較強(qiáng)的抗氧化作用?；谝陨涎芯勘尘?本實驗擬在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞觀察s

4、elaginellin對Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的影響并探討可能涉及的機(jī)制。
　　 方法：
　　 原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)。MTS法檢測細(xì)胞活力;以β-半乳糖苷酶活性(染色法)、端粒酶活性(Real time PCR法)和細(xì)胞周期分布(流式)檢測細(xì)胞衰老;用活性氧熒光試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成;實時定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Sirtl mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Hcy(0.5 M

5、)處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h,能顯著降低細(xì)胞活性;selaginellin(10-7,3×10-7和10-6 M)預(yù)處理1 h能顯著抑制Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降,且呈濃度依賴性;
　　 (2)Hcy(0.5 M)處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h,能顯著增加β-半乳糖苷酶活性,降低細(xì)胞端粒酶活性,增加G1期細(xì)胞比例,提示Hcy能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老;Selaginellin(10-7,3×10-7和10-6 M)預(yù)處理1 h能顯著抑制Hcy誘導(dǎo)的β-半

6、乳糖苷酶活性增加,端粒酶活性的降低及G1期細(xì)胞比例的增加,且呈濃度依賴性;
　　 (3)Hcy(0.5 M)處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h,能顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平;Selaginellin(10-7,3×10-7和10-6M)預(yù)處理1 h能濃度依賴性地抑制Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加;
　　 (4)Hcy(0.5 M)處理內(nèi)皮細(xì)胞48 h,能顯著降低Sirtl mRNA表達(dá):而selaginellin本身能顯著上調(diào)Sirt

7、l mRNA表達(dá),且能逆轉(zhuǎn)Hcy誘導(dǎo)的Sirtl mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 Selaginellin能抑制Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老,其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和上調(diào)Sirtl表達(dá)有關(guān)。
　　 第二章 Selaginellin抑制谷氨酸和氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡
　　 第一節(jié) Selaginellin抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷和凋亡
　　 研究背景：
　　

8、谷氨酸(Glutamate,Glu)是一種興奮性氨基酸,對神經(jīng)系統(tǒng)正常的功能活動起著重要的維持作用。然而,在某些病理情況下,如阿爾茨海默病、亨廷頓病及帕金森病等,谷氨酸大量堆積釋放,可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷和缺失。谷氨酸主要通過兩種途徑誘發(fā)神經(jīng)死亡:興奮性毒性和氧化應(yīng)激。前者通過谷氨酸離子型受體的過度激活,導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載引發(fā)細(xì)胞死亡;后者為谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑。卷柏具有降血壓、降血糖、增強(qiáng)人體免疫功能和抑制氧化應(yīng)激等作用,其

9、粗提取物能加速自由基的清除,激活過氧化物岐化酶。Selaginellin是我院從卷柏中提取的一種單體,具有抗氧化作用。本實驗在分化的PC12細(xì)胞,研究selaginellin對Glu誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡的保護(hù)作用。依據(jù)Klotho是一個新的抗衰老基因,能延緩多種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激有關(guān),因此,我們進(jìn)一步探討selaginellin的抗凋亡作用是否與上調(diào)Klotho基因有關(guān)。
　　 方法：
　　 實

10、驗分設(shè)正常對照組、Glu損傷組、Glu+3個濃度的selaginellin(10-7、3×10-7和10-6 M)組和溶媒對照組。各藥物處理組預(yù)先同分化的PC12細(xì)胞孵育1 h后,再用Glu(10 mM)處理24 h。以細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞活性(MTS法)和LDH漏出(比色法)檢測細(xì)胞損傷;以Hoechst染色和caspase-3活性檢測細(xì)胞凋亡;用活性氧熒光試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成;實時定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)KlothomRNA的表

11、達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)PC12細(xì)胞株在含100 ng/mL NGF的培養(yǎng)液中孵育7 d后,細(xì)胞分化為分裂后期神經(jīng)元樣細(xì)胞株,生成大量樹突;
　　 (2)MTS結(jié)果顯示:5-20 mM Glu濃度依賴性地降低PC12細(xì)胞活性,其中,10 mM Glu可降低45％的細(xì)胞活性;
　　 (3)形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:對照組PC12細(xì)胞邊緣清晰,胞膜完整,樹突完整;10 mM Glu孵育24 h后,胞體皺縮,樹突

12、斷裂,細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失;Selaginellin預(yù)處理可濃度依賴性地減輕Glu對PC12細(xì)胞的損傷。與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化相一致,Glu可明顯增加LDH漏出和降低細(xì)胞活性,selaginellin可濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)Glu的上述效應(yīng);
　　 (4)Hoechst33342染色結(jié)果顯示:Glu處理24 h顯著增加細(xì)胞皺縮,胞核碎裂和染色質(zhì)聚集,Hoechst染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。與之一致的是caspase-3活性顯著增加。Glu的促凋亡

13、效應(yīng)可濃度依賴性地被selaginellin所抑制;
　　 (5)Glu(10 mM)處理細(xì)胞24 h可明顯增強(qiáng)活性氧水平;預(yù)先用selaginellin處理1 h后,能呈濃度依賴性地抑制Glu誘導(dǎo)的活性氧生成增加;
　　 (6)Glu可顯著下調(diào)PC12細(xì)胞Klotho mRNA的表達(dá),selaginellin預(yù)處理能顯著抑制Glu所致Klotho mRNA的下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 Selaginel