多酚類化合物LM49對血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　課題組前期合成一種全新結構的多酚類化合物LM49，該化合物不僅具有很強的體外抗氧化活性，而且有顯著的抗大鼠動脈粥樣硬化、抗心肌缺血再灌注損傷等多種藥理活性，但其具體機制尚不清楚。因此本論文試圖通過LM49對H2O2誘導血管內(nèi)皮細胞氧化損傷及對糖尿病大鼠的保護作用及其可能的分子機制進行探討，為此類化合物的進一步研究及其應用提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用MTT法檢測H2O2對EA.hy926細胞活力影響

2、及LM49對H2O2誘導的EA.hy926細胞活力下降的抑制作用；
　?。?）采用人全基因組表達譜芯片技術研究LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞損傷保護作用的調(diào)控機制；
　?。?）采用Western blot檢測LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞NOD1、NF-κB、ICAM-1、E-selectin及MAPK的表達影響；
　?。?）采用細胞免疫熒光法檢測LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞NF-

3、κB核轉入水平的影響；
　　（5）采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞凋亡的影響；
　?。?）采用RT-PCR檢測LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞凋亡相關蛋白Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達影響；
　　（7）采用Western blot檢測LM49對H2O2誘導EA.hy926細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-

4、3的表達影響；
　?。?）采用高糖高脂飼料結合STZ聯(lián)合誘導建立糖尿病大鼠模型進行LM49體內(nèi)抗炎、抗氧化作用研究，通過血糖測定、血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6、MDA含量及氧化還原酶SOD、GSH-Px活性檢測，初步闡明LM49具有體內(nèi)抗炎及抗氧化活性。
　　結果：
　　（1）LM49在濃度小于20μmol/L時對EA.hy926細胞活力沒有影響；
　　（2）LM49在5、10和20μmol

5、/L濃度時具有明顯抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞活力下降作用（p<0.05），并呈明顯劑量依賴關系；
　　（3）基因芯片分析結果表明H2O2組與正常對照組比較，其差異基因數(shù)量為182條，其中上調(diào)表達基因數(shù)量為141條，下調(diào)表達基因數(shù)量為41條；LM49保護作用組與H2O2組比較，其差異基因數(shù)量為1083條，其中上調(diào)表達基因數(shù)量為419條，下調(diào)表達基因數(shù)量為664條，且多條差異基因與炎癥和凋亡相關，諸如趨化因子（chemok

6、in）相關基因（CCL2、CXCR4、CXCL3、CXCL6及CCL3）、白介素（interleukin，IL）相關基因（IL18、IL32、IL6ST、IL20RB、IL6）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF）相關基因（TNFSF14、TNFAIP、TNFRSF10D）、NOD樣受體基因（NAIP、NLRP3）、凋亡相關基因（CASP8、CASP1）及線粒體細胞色素相關基因（CYB5RL、CYCS、C

7、YP1B1、CYP2U1）等；
　?。?）對差異基因進行GO分析表明LM49參與了及炎癥反應和凋亡過程；
　?。?）對差異基因進行KEGG分析表明LM49保護作用組與H2O2組所篩選的NOD樣受體信號通路在差異基因比例和差異的顯著性均較其它通路明顯；
　?。?）Western blot檢測結果表明LM49對H2O2誘導的EA.hy926細胞NOD1、NF-κB、ICAM-1、E-selectin表達及ERK1/2、p-

8、p38MAPK蛋白激酶磷酸化水平具有明顯抑制作用（p<0.05），且抑制作用呈明顯劑量關系；
　　（7）細胞免疫熒光法檢測結果表明LM49對H2O2誘導的EA.hy926細胞NF-κB核轉入水平具有明顯抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量關系；
　?。?）Annexin V-FITC/PI雙染實驗表明LM49在0、5、10和20μmol/L濃度時對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡率分別為14.9％、12.5%、7.7%和

9、6.1%，表明LM49對H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡具有顯著抑制作用（p<0.05）；
　?。?）RT-PCR和Western blot檢測結果表明，LM49在5、10和20μmol/L濃度時顯著抑制H2O2誘導EA.hy926細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和Bax mRNA表達及cleaved caspase-3表達的升高，同時抑制抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2 mRNA表達的降低（p<0.05），且抑制作用呈明顯劑量關系；

10、
　?。?0）高糖高脂飼料結合STZ誘導建立糖尿病大鼠模型研究表明：LM49能夠降低糖尿病大鼠的血糖，降低糖尿病大鼠血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6、MDA的含量（p<0.05）及提高氧化還原酶SOD、GSH-Px的活性（p<0.05），初步表明LM49對糖尿病大鼠有一定的抗炎及抗氧化作用。
　　結論：
　?。?）LM49能夠抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞損傷，差異基因和信號通路分析表明其作用

11、機制可能與抗凋亡和抗炎作用相關；
　?。?）LM49抑制H2O2誘導的EA.hy926炎癥反應，與調(diào)控NOD1及下游NF-κB、MAPK炎癥信號通路有關；
　　（3）LM49抑制H2O2誘導的EA.hy926細胞凋亡，與調(diào)控Bcl-2和Bax基因、蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表達相關；
　?。?）LM49具有降低糖尿病大鼠血糖，降低血清中NOD1、NF-κB、ICAM-1、IL-6及MDA含量，且提高