晉南牛和山羊瘤胃產甲烷菌多樣性研究.pdf

1、瘤胃產甲烷菌代謝產生的甲烷氣體，既是飼料能量的損失，又能引起溫室效應，因此成為當前的一個研究熱點，了解瘤胃產甲烷菌群的組成及其多樣性是對其菌群結構進行調控，并最終控制甲烷產生的基礎.迄今為止，國內對瘤胃產甲烷菌群多樣性的研究尚無報道，國外的相關研究多集中于綿羊和奶牛瘤胃中產甲烷菌的多樣性，而對于產甲烷菌消化道不同部位(如瘤胃和盲腸)的分布方面鮮見報道。為此，本研究以晉南牛和山羊為試驗動物，以克隆產甲烷古菌16S rRNA基因并測序的方法

2、，研究了晉南牛和山羊瘤胃產甲烷古菌的多樣性，并通過比較克隆庫間的差異，揭示了產甲烷菌在瘤胃和盲腸中分布特點，為探討我國反芻動物瘤胃甲烷調控奠定基礎。試驗分以下四部分進行. 1.研究瘤胃產甲烷古菌分子多樣性的引物篩選 采用兩對古菌特異性引物(Arch f364/1386和1Af/1100Ar)和一對產甲烷菌特異性引物(Met86F/Met1340R)克隆晉南牛瘤胃產甲烷古菌的16S rRNA基因，每對引物對應的克隆庫各隨機

3、挑選100個插入片段長度正確的克隆，比較不同引物建立的克隆庫，以選擇出適合反映瘤胃產甲烷古菌多樣性的引物，結果顯示，利用引物Archf364/1386建立的克隆庫中，克隆的最相似菌分別為4株甲烷短桿菌1Y(61％)、SM9(23％)、NT7(14％)和AK-87(2％).利用引物1Af/1100Ar建立的克隆庫中，克隆分別與Methanobacterium aarhusense(72％)和Methanosphaera stadtmana

4、e DSM3091(28％)相似.利用引物Met86F/Met1340R建立的克隆庫中，除以上4株甲烷短桿菌(所占比例分別為47％、26％、11％和3％)和類似M aarhusense(1％)和M.stadtmanae(3％)的序列外，還包括Methanomicrobium mobile(2％)以及7％與Aciduliprofundum boonei相似性在81％-82％之間的序列，結果說明，相對其它兩對引物，引物Met86F/Met1

5、340R克隆的瘤胃產甲烷古菌種類最多，歸屬于甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷球形菌屬(Methanosphaera)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium)，以及未知菌等廣域古菌的五個分支，能較全面地反映晉南牛瘤胃產甲烷菌菌群結構，適于研究瘤胃產甲烷菌的多樣性。結果同時發(fā)現，晉南牛瘤胃中，有25個OTU屬于廣域古菌的未知序列，提示瘤胃中存在大量的未知產甲烷

6、菌。 2.產甲烷古菌在瘤胃中的生態(tài)分布研究 采用產甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R，分別建立了晉南牛瘤胃液相(liquid-associated methanogen，LAM)、附著于瘤胃固相(solid-associated methanogen，SAM)和附著于瘤胃壁(epithelium-associated methanogen，EAM)上的產甲烷古菌16SrRNA基因克隆庫，以比較瘤胃產甲烷菌在此

7、三相間的分布差異。LAM、SAM和EAM三個克隆庫檢測的克隆數分別為268個、135個和267個.比較三個克隆庫，其中皆以甲烷短桿菌屬的克隆為主，分別占克隆總數的86.94％、77.78％和76.12％，且均舍有1Y和SM9兩株產甲烷短桿菌及類似M alcaliphilum、M stadtmanae和A.boonei的序列；此外，可活動甲烷短桿菌和類似M aarhusense、M stadtmanii和Methanobrevibacte

8、r sp. Ab M4的序列僅存在于LAM克隆庫中；反芻獸甲烷短桿菌僅存在于SAM克隆庫中；類似Methanobrevibacter sp. SM9的序列僅存在于EAM克隆庫中；而類似Methanobrevibacter sp. AK-87的序列存在于LAM和SAM克隆庫中；在LAM、SAM和EAM克隆庫中，分別有12.30％、23.69％和24.71％的克隆是未確定的廣域古菌序列，其中有五個序列(E17、E18、E19、L25和S14

9、)是新發(fā)現的廣域古菌序列。結果表明，產甲烷古菌在瘤胃中的分布不均勻，附著于瘤胃液相、固相和上皮上的產甲烷古菌菌群存在一定的差異。 3.瘤胃與盲腸中產甲烷吉菌的比較研究 采用產甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R，建立了晉南牛瘤胃和盲腸中產甲烷古菌的克隆庫，以比較兩個消化部位產甲烷古菌菌群的差異，每個克隆庫中分別隨機檢測200個克隆，根據限制性內切酶酶切和測序的結果，瘤胃克隆庫中的克隆分別與M alcaliphi

10、lum(1％)，M aarhusense(2％)，M stadtmanae(3％)，M stadtmanii(1％)，可活動甲烷微菌(2％)，A.boonei(11.5％)，和甲烷短桿菌屬的反芻獸(0.5％)，SM9(26％)，1Y(44.5％)，AK-87(6％)，NT7(2％)，AbM4(0.5％)等菌最相似.盲腸克隆庫中，克隆的最相似菌分別為M.alcaliphilum(5％)，M.aarhusense(1％)，M.stadtma

11、nae(4％)，和甲烷短桿菌屬的SM9(54.5％)，1Y(27％)，AK-87(6.5％)，NT7(2％).比較兩個克隆庫，在盲腸內未克隆到存在于瘤胃克隆庫中的可活動甲烷微菌和類似于Methanobrevibacter sp.1Y、M stadtmanii. Methanobrevibacter sp.AbM4和A.boonei的克隆，而瘤胃中未克隆獲得類似Methanobrevibacter sp. SM9的克隆。結果表明，瘤胃與盲

12、腸的產甲烷菌菌群存在一定的差異，盲腸中的產甲烷菌種類較單一。 4.山羊瘤胃產甲烷古菌的分子多樣性研究 采用產甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R和古菌通用引物w017/ w002研究了山羊瘤胃產甲烷古菌16S rRNA基因的多樣性，以反映山羊瘤胃產甲烷菌菌群。每個克隆庫隨機挑選100個克隆.引物Met86F/Met1340R建立的克隆庫中，克隆的最相似菌分別為M.stadtmanae(1％)、M.aarhuse

13、nse(2％)、A.boonei(3％)及6株甲烷短桿菌AK-87(62％)、ZA-10(19％)、OCP(7％)、SM9(2％)、30Y(2％)和1Y(2％).引物w017/w002建立的克隆庫中，未知廣域古菌菌隆占克隆總數的97％，克隆分別與Methanosphaera stadtmanii(47％)、Methanobrevibacter sp.SM9(1％)、Methanobacteriumsp. DSM11106(21％)、M.