晉南牛和山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性研究.pdf

1、瘤胃產(chǎn)甲烷菌代謝產(chǎn)生的甲烷氣體，既是飼料能量的損失，又能引起溫室效應(yīng)，因此成為當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，了解瘤胃產(chǎn)甲烷菌群的組成及其多樣性是對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，并最終控制甲烷產(chǎn)生的基礎(chǔ).迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌群多樣性的研究尚無(wú)報(bào)道，國(guó)外的相關(guān)研究多集中于綿羊和奶牛瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的多樣性，而對(duì)于產(chǎn)甲烷菌消化道不同部位(如瘤胃和盲腸)的分布方面鮮見報(bào)道。為此，本研究以晉南牛和山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，以克隆產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA基因并測(cè)序的方法

2、，研究了晉南牛和山羊瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的多樣性，并通過(guò)比較克隆庫(kù)間的差異，揭示了產(chǎn)甲烷菌在瘤胃和盲腸中分布特點(diǎn)，為探討我國(guó)反芻動(dòng)物瘤胃甲烷調(diào)控奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)分以下四部分進(jìn)行. 1.研究瘤胃產(chǎn)甲烷古菌分子多樣性的引物篩選 采用兩對(duì)古菌特異性引物(Arch f364/1386和1Af/1100Ar)和一對(duì)產(chǎn)甲烷菌特異性引物(Met86F/Met1340R)克隆晉南牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的16S rRNA基因，每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的克隆庫(kù)各隨機(jī)

3、挑選100個(gè)插入片段長(zhǎng)度正確的克隆，比較不同引物建立的克隆庫(kù)，以選擇出適合反映瘤胃產(chǎn)甲烷古菌多樣性的引物，結(jié)果顯示，利用引物Archf364/1386建立的克隆庫(kù)中，克隆的最相似菌分別為4株甲烷短桿菌1Y(61％)、SM9(23％)、NT7(14％)和AK-87(2％).利用引物1Af/1100Ar建立的克隆庫(kù)中，克隆分別與Methanobacterium aarhusense(72％)和Methanosphaera stadtmana

4、e DSM3091(28％)相似.利用引物Met86F/Met1340R建立的克隆庫(kù)中，除以上4株甲烷短桿菌(所占比例分別為47％、26％、11％和3％)和類似M aarhusense(1％)和M.stadtmanae(3％)的序列外，還包括Methanomicrobium mobile(2％)以及7％與Aciduliprofundum boonei相似性在81％-82％之間的序列，結(jié)果說(shuō)明，相對(duì)其它兩對(duì)引物，引物Met86F/Met1

5、340R克隆的瘤胃產(chǎn)甲烷古菌種類最多，歸屬于甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷球形菌屬(Methanosphaera)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium)，以及未知菌等廣域古菌的五個(gè)分支，能較全面地反映晉南牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)，適于研究瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性。結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)，晉南牛瘤胃中，有25個(gè)OTU屬于廣域古菌的未知序列，提示瘤胃中存在大量的未知產(chǎn)甲烷

6、菌。 2.產(chǎn)甲烷古菌在瘤胃中的生態(tài)分布研究 采用產(chǎn)甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R，分別建立了晉南牛瘤胃液相(liquid-associated methanogen，LAM)、附著于瘤胃固相(solid-associated methanogen，SAM)和附著于瘤胃壁(epithelium-associated methanogen，EAM)上的產(chǎn)甲烷古菌16SrRNA基因克隆庫(kù)，以比較瘤胃產(chǎn)甲烷菌在此

7、三相間的分布差異。LAM、SAM和EAM三個(gè)克隆庫(kù)檢測(cè)的克隆數(shù)分別為268個(gè)、135個(gè)和267個(gè).比較三個(gè)克隆庫(kù)，其中皆以甲烷短桿菌屬的克隆為主，分別占克隆總數(shù)的86.94％、77.78％和76.12％，且均舍有1Y和SM9兩株產(chǎn)甲烷短桿菌及類似M alcaliphilum、M stadtmanae和A.boonei的序列；此外，可活動(dòng)甲烷短桿菌和類似M aarhusense、M stadtmanii和Methanobrevibacte

8、r sp. Ab M4的序列僅存在于LAM克隆庫(kù)中；反芻獸甲烷短桿菌僅存在于SAM克隆庫(kù)中；類似Methanobrevibacter sp. SM9的序列僅存在于EAM克隆庫(kù)中；而類似Methanobrevibacter sp. AK-87的序列存在于LAM和SAM克隆庫(kù)中；在LAM、SAM和EAM克隆庫(kù)中，分別有12.30％、23.69％和24.71％的克隆是未確定的廣域古菌序列，其中有五個(gè)序列(E17、E18、E19、L25和S14

9、)是新發(fā)現(xiàn)的廣域古菌序列。結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷古菌在瘤胃中的分布不均勻，附著于瘤胃液相、固相和上皮上的產(chǎn)甲烷古菌菌群存在一定的差異。 3.瘤胃與盲腸中產(chǎn)甲烷吉菌的比較研究 采用產(chǎn)甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R，建立了晉南牛瘤胃和盲腸中產(chǎn)甲烷古菌的克隆庫(kù)，以比較兩個(gè)消化部位產(chǎn)甲烷古菌菌群的差異，每個(gè)克隆庫(kù)中分別隨機(jī)檢測(cè)200個(gè)克隆，根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序的結(jié)果，瘤胃克隆庫(kù)中的克隆分別與M alcaliphi

10、lum(1％)，M aarhusense(2％)，M stadtmanae(3％)，M stadtmanii(1％)，可活動(dòng)甲烷微菌(2％)，A.boonei(11.5％)，和甲烷短桿菌屬的反芻獸(0.5％)，SM9(26％)，1Y(44.5％)，AK-87(6％)，NT7(2％)，AbM4(0.5％)等菌最相似.盲腸克隆庫(kù)中，克隆的最相似菌分別為M.alcaliphilum(5％)，M.aarhusense(1％)，M.stadtma

11、nae(4％)，和甲烷短桿菌屬的SM9(54.5％)，1Y(27％)，AK-87(6.5％)，NT7(2％).比較兩個(gè)克隆庫(kù)，在盲腸內(nèi)未克隆到存在于瘤胃克隆庫(kù)中的可活動(dòng)甲烷微菌和類似于Methanobrevibacter sp.1Y、M stadtmanii. Methanobrevibacter sp.AbM4和A.boonei的克隆，而瘤胃中未克隆獲得類似Methanobrevibacter sp. SM9的克隆。結(jié)果表明，瘤胃與盲

12、腸的產(chǎn)甲烷菌菌群存在一定的差異，盲腸中的產(chǎn)甲烷菌種類較單一。 4.山羊瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的分子多樣性研究 采用產(chǎn)甲烷菌特異性引物Met86F/Met1340R和古菌通用引物w017/ w002研究了山羊瘤胃產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA基因的多樣性，以反映山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌菌群。每個(gè)克隆庫(kù)隨機(jī)挑選100個(gè)克隆.引物Met86F/Met1340R建立的克隆庫(kù)中，克隆的最相似菌分別為M.stadtmanae(1％)、M.aarhuse

13、nse(2％)、A.boonei(3％)及6株甲烷短桿菌AK-87(62％)、ZA-10(19％)、OCP(7％)、SM9(2％)、30Y(2％)和1Y(2％).引物w017/w002建立的克隆庫(kù)中，未知廣域古菌菌隆占克隆總數(shù)的97％，克隆分別與Methanosphaera stadtmanii(47％)、Methanobrevibacter sp.SM9(1％)、Methanobacteriumsp. DSM11106(21％)、M.