PCR-DGGE技術(shù)在水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌探索中的應(yīng)用.pdf

1、反芻動物瘤胃溫度恒定而且高度厭氧，是一個非常復(fù)雜的活體環(huán)境。這里生活著細(xì)菌，真菌，原蟲等，然而至今80％以上生活在瘤胃內(nèi)的微生物都不可培養(yǎng)，即便是可以得到純培養(yǎng)的瘤胃微生物也只能通過表觀的一些理化性質(zhì)的鑒定加以認(rèn)識。近年來，基于16SrRNA的分子生物學(xué)的方法為揭示微生物菌群多樣性提供了更有力的幫助。
　　 本文通過使用PCR-DGGE技術(shù)對廣西本地沼澤型水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌進行探索，具體結(jié)果如下：
　　 1、采集廣西本地

2、沼澤型水牛瘤胃內(nèi)容物，過濾處理后將樣品分別經(jīng)反復(fù)凍溶、液氮研磨和超聲波三種方法破碎細(xì)胞,然后加入含有蛋白酶K的消化液恒溫消化，將消化后的樣品經(jīng)經(jīng)典的酚/氯仿法提取DNA。檢驗DNA濃度和純度，進行瓊脂糖電泳，并做PCR驗證。結(jié)果表明，反復(fù)凍溶法提取水牛瘤胃微生物總DNA效果最好。
　　 2、采用ARC344f-GC/519r,ARCH915-GC/UNI-b-rev,PARCH519f/ARC915r-GC，ARC344f-GC

3、/ARC915r四對帶有“GC夾板”的產(chǎn)甲烷古菌通用引物擴增水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌高變區(qū)16SrRNA基因序列。因引物的不同選擇合適的PCR體系和程序進行擴增，并進行瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果表明，3、選用引物ARCH519f/ARC915r-GC擴增的PCR產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。由DGGE電泳圖譜條帶分散情況，可以看到菌群呈現(xiàn)多樣性。由聚類樹圖，可以看到樣品個體間存在差異。將9條克隆所得基因序列放入GenBank中進行BLAST