牙周牙髓聯(lián)合病變細(xì)菌的PCR-DGGE分析.pdf

1、目的：牙周炎和牙髓根尖周病的發(fā)病因素和病理過程雖不完全相同，但牙周袋內(nèi)和感染牙髓內(nèi)都存在以厭氧菌為主的混合感染，它們所引起的炎癥和免疫反應(yīng)有許多相似之處，二者的感染和病變可以相互擴(kuò)散和影響，導(dǎo)致牙周牙髓聯(lián)合病變的發(fā)生。關(guān)于牙周炎和牙髓根尖周病作為獨(dú)立的病變形態(tài)的細(xì)菌學(xué)研究，數(shù)量很多，涉及方面亦很廣泛。而介于二者“交叉地帶”的牙周牙髓聯(lián)合病變的細(xì)菌學(xué)研究要相對(duì)的少一些，而且這些研究多以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)為基本手段，對(duì)已知細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)和相關(guān)研究

2、，對(duì)于未能人工培養(yǎng)的細(xì)菌和未知菌的關(guān)注很少，而相關(guān)研究表明，口腔中不能被培養(yǎng)出來的微生物種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于能夠培養(yǎng)的微生物，因此我們可以認(rèn)為之前以培養(yǎng)為研究手段的研究結(jié)果，并不能了解牙髓炎和根尖周炎微生物群體的全貌。現(xiàn)代微生物技術(shù)中的變性梯度凝膠技術(shù)(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)可比較直觀的呈現(xiàn)某種環(huán)境中微生物的群落情況與變化，并獲取不可培養(yǎng)細(xì)菌和未知菌的基因組資源，為進(jìn)一步深入了

3、解牙周牙髓聯(lián)合病變的微生物種群全貌提供了新的手段。
　　 本文利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)觀察牙周牙髓聯(lián)合病變患牙牙周組織和根管中原始菌群分布狀況及其異同，并通過克隆測(cè)序技術(shù)來試圖探討兩部位可能存在的優(yōu)勢(shì)菌，為該病變的進(jìn)一步研究奠定一定的細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、牙周牙髓聯(lián)合病變菌群結(jié)構(gòu)的研究
　　 從13例牙周牙髓聯(lián)合病變患牙分別采集患牙根尖1/3處牙周細(xì)菌和根管牙髓細(xì)菌，提取細(xì)菌總DNA，以其

4、為模板擴(kuò)增16SrRNA基因可變區(qū)，再進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，觀察菌種條帶分布情況。用QuantityOne軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行相似系數(shù)(DiceCoefficient)計(jì)算和聚類分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 2、牙周牙髓聯(lián)合病變具體菌種的研究
　　 對(duì)DGGE凝膠中有代表性的條帶進(jìn)行切膠回收，隨后克隆測(cè)序，通過BLAST序列比對(duì)，了解某些條帶對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌種。
　　 結(jié)果：<

5、br>　　 1、13例樣本的DGGE圖譜條帶數(shù)的配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示牙周、牙髓樣本的菌種條帶數(shù)之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示二者之間無正相關(guān)性。同牙的牙周、牙髓菌種條帶相似系數(shù)(DiceCoefficient)為13.1％-62.5％不等。
　　 2、DGGE凝膠條帶回收克隆測(cè)序BLAST(≧98％序列相似度)的結(jié)果顯示:牙周牙髓聯(lián)合病變患牙根尖區(qū)1/3處牙周菌種可能有Campyloba

6、cter,Fusobacterium,Neisseria,Peptostreptococcus,Veillonella，Aggregatibacter，Enterobacter，Haemophilus等，該處對(duì)應(yīng)根管中菌種可能有Mogibacterium，Corynebacterium，Neisseria，Actinomyces等。約50％測(cè)序序列BLAST結(jié)果序列相似度＜95％。
　　 結(jié)論：
　　 1、牙周牙髓聯(lián)合病