應用PCR-DGGE和rep-PCR技術對大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道菌群多樣性的研究.pdf

1、研究目的:
　　 肝移植是目前各種急、慢性終末期肝病及肝衰竭最有效的治療手段。感染和排斥,仍是肝移植術后最常見的兩大并發(fā)癥。由于肝臟與腸道不僅在解剖結構,而且在功能上有著密切的聯(lián)系,腸道作為人體最大的貯菌庫和內(nèi)毒素庫,在特定條件下可以釋放多種毒性物質,導致腸源性感染的發(fā)生,并加重肝臟的損害。肝硬化患者腸道菌群發(fā)生明顯的易位,革蘭陰性需氧菌明顯增多,以腸桿菌科細菌為主,厭氧菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌減少,但肝硬化肝移植術后腸道菌群的多

2、樣性變化鮮有報道。腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加、免疫功能失調及手術缺血再灌注損傷等均是造成肝移植后腸道菌群變化的重要原因。本研究應用基于16S rRNA特異性基因的指紋圖譜分析(PCR-DGGE)、屬特異性引物Real-time PCR對大鼠及成人肝移植后腸道菌群的多樣性進行研究,并嘗試應用細菌基因組間重復序列的DNA指紋圖譜(rep-PCR)技術對腸道菌群多樣性變化進行初步研究,探討大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道菌群多樣

3、性的變化,觀察腸道菌群變化的規(guī)律,優(yōu)化腸道微生態(tài),預防肝移植后感染的發(fā)生,為肝硬化、肝移植患者的治療和預后提供一定的參考價值。
　　 材料和方法:
　　 1、成功建立CCL4誘導的SD大鼠肝硬化模型,選擇健康的SD大鼠對肝硬化模型組進行肝移植,采集正常對照組、肝硬化模型組、肝硬化肝移植術后7d組、肝硬化肝移植術后30 d組的糞便標本,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、收集健康成人、肝炎肝硬化患者、肝移植術后患者

4、的糞便標本,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、提取上述各組糞便細菌基因組DNA,然后用16S rDNA V3區(qū)通用引物擴增細菌總DNA,對擴增PCR產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。
　　 4、應用腸道優(yōu)勢菌群屬特異性引物,進行6種細菌的Real-time PCR檢測,明確這6種優(yōu)勢細菌在大鼠和成人肝硬化肝移植后腸道中的變化情況。
　　 5、利用細菌基因組內(nèi)重復序列引物包括BOX-PCR,ERIC-PCR,

5、ERIC2-PCR,(GTG)5-PCR,REP-PCR對大鼠及成人糞便細菌基因組DNA進行擴增電泳,分析指紋圖譜。
　　 結果:
　　 1、成功建立了SD大鼠肝硬化模型(造模組大鼠肝臟病理見假小葉形成),并對其成功進行了肝移植,移植后SD大鼠1只出血死亡,其余排斥反應較輕,移植組大鼠生活良好。
　　 2、PCR-DGGE圖譜分析可明確將大鼠及成人正常對照組、肝硬化組、肝移植組均分為3個簇,并顯示出大鼠肝硬化、肝

6、移植后腸道菌群多樣性明顯增多,而成人肝硬化、肝移植后腸道菌群多樣性有所減少,肝硬化發(fā)生過程中,腸道菌群中優(yōu)勢菌群如擬桿菌屬(Bacteroides)的數(shù)量減少,腸桿菌科細菌如Prevotella菌等數(shù)量增多,肝移植后菌群多樣性變化有所恢復,但仍未回到正常水平。
　　 3、Real-time PCR檢測結果顯示,肝硬化大鼠中擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬細菌明顯減少,腸球菌屬、腸桿菌屬細菌明顯增加。而成人中肝硬化組梭菌屬

7、、雙歧桿菌屬細菌明顯減少,而腸球菌屬細菌明顯增加。
　　 4、rep-PCR技術也可將大鼠及成人正常對照組、肝硬化組、肝移植組區(qū)分開,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR-三者擴增條帶各組差異顯著,鑒別效果更好。
　　 5、PCR-DGGE主要分析腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的多樣性,可明確腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的種類變化。rep-PCR技術將腸內(nèi)菌群作為整體,研究微生物菌群多樣性的整體變化。rep-PCR和PCR-DGG

8、E技術在大鼠及成人肝硬化肝移植后腸道微生態(tài)的研究中具有相似的鑒別力,但PCR-DGGE的分辨率更好。
　　 結論:
　　 SD大鼠及成人肝硬化后肝移植的腸道菌群多樣性發(fā)生明顯變化,其中以肝硬化組變化最為明顯,肝移植術后腸道菌群有向正?；謴偷内厔荨胷ep-PCR和PCR-DGGE技術一樣,均可將肝移植前后腸道菌群多樣性差異分辨出,尤其是ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR鑒別效果更好,可為監(jiān)測菌群多樣性