利用PCR-DGGE法對(duì)樟子松有機(jī)凋落物層真菌多樣性及高頻菌株酶活研究.pdf

1、本研究利用傳統(tǒng)的分離鑒定方法與具有可靠性強(qiáng)、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)的PCR-DGGE技術(shù)相結(jié)合，對(duì)帽兒山地區(qū)人工樟子松林凋落物有機(jī)層分解真菌菌群的多樣性進(jìn)行了研究。同時(shí)，通過發(fā)酵純培養(yǎng)方法對(duì)高頻出現(xiàn)的三株絲狀真菌分泌的木質(zhì)纖維素酶活性進(jìn)行了深入研究。
　　 通過傳統(tǒng)分離手段共獲得21個(gè)樟子松凋落物分解真菌種類，大多數(shù)為半知菌類，其中包括5種未知菌。另外，在利用PCR-DGGE手段研究凋落物真菌多樣性中，首先利用Bead-Beating法

2、直接對(duì)凋落物L(fēng)層、F1層、F2層和H層分別提取總基因組，然后以nu-0817-5'與nu-1536-3'、nu-0817-5'與nu-1196-3'-GC兩對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR，特異性地?cái)U(kuò)增18S rDNA序列中的V4-V8區(qū)域，最后將所得到約460bp的擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行分析，結(jié)果獲得清晰且可重復(fù)的條帶。DGGE測(cè)序結(jié)果分別為Aureobasidium pullulans、Ascomycotasp.、Spor

3、obolomyces inositophilus、Desmazierella acicola、Pulchromyces fimicola、Uncultured Hypocreales、Geopyxis majalis。通過相似性分析表明，隨著分解程度的加深，H層與其他分解層的真菌菌群圖譜的相似性逐漸降低，但L層、F1層和F2層之間相比，真菌群落結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著變化。綜合來看，真菌菌株Sporobolomycesinositophilus

4、均被PCR-DGGE和傳統(tǒng)分離兩種技術(shù)檢測(cè)到，除此以外，兩種方法分別檢測(cè)到的其他真菌種類都未有重疊和相似。
　　 選取在樟子松凋落物L(fēng)層和F層高頻出現(xiàn)的三株絲狀真菌：Alternaria sp.，Penicillium sp.和Pestalotiopsis sp.作為研究對(duì)象，以樟子松新鮮落葉為作用底物。通過發(fā)酵純培養(yǎng)的方法，測(cè)定底物質(zhì)量損失及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶(EC3.2.1.4)、濾紙酶(EC3.2.1.91)、