PCR-DGGE技術(shù)分析乳桿菌多樣性及其在攻毒犬與治療犬腸道內(nèi)乳桿菌多樣性中的應(yīng)用.pdf

1、本研究通過(guò)特異性引物P1擴(kuò)增乳桿菌16S rDNA部分序列，結(jié)合DGGE技術(shù)對(duì)斷奶幼犬的治療組與攻毒組進(jìn)行乳桿菌多樣性分析。期望建立一種快速、簡(jiǎn)單分析乳桿菌多樣性的方法并了解健康和腹瀉仔犬的乳桿菌變化，為仔犬腸道環(huán)境指標(biāo)和體系的建立、針對(duì)斷奶仔犬乳桿菌微生態(tài)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。本文的主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1.引物P1通過(guò)利用BlastPrograms對(duì)105種或業(yè)種乳桿菌進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)P1在乳桿菌16SrDNA上6

2、77～693區(qū)域有高度靶向性；同時(shí)又對(duì)腸道優(yōu)勢(shì)菌群Closditum,Eubact-erium，Bacteroides,Bifidobacterium等進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)引物P1在這些細(xì)菌的16SrDNA存在堿基不匹對(duì)。該結(jié)果隨后通過(guò)PCR結(jié)合測(cè)序結(jié)果證明了P1只能擴(kuò)增乳桿菌。通過(guò)對(duì)巢式PCR及DGGE條件的優(yōu)化，建立了利用DGGE技術(shù)分析腸道乳桿菌多樣性的方法。
　　 2.選取健康幼齡犬16只，分四組，分別為對(duì)照組A(芽孢桿菌對(duì)照

3、組)、對(duì)照組B（空白對(duì)照組）、治療組（沙門桿菌攻毒，芽孢桿菌治療組）、攻毒組（沙門桿菌攻毒組），每組4個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期為9d。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示：未飼喂芽孢桿菌的攻毒組，4只犬都出現(xiàn)了腹瀉，飼喂了芽孢桿菌的治療組只有一只出現(xiàn)了腹瀉現(xiàn)象，對(duì)照組無(wú)腹瀉現(xiàn)象，說(shuō)明治療犬與攻毒犬模型建立成功。
　　 3.應(yīng)用PCR-DGGE分析腸道菌群結(jié)果表明：①試驗(yàn)0d各組間DGGE圖譜條帶相似性都在57％以上，圖譜條帶組內(nèi)和各組間都沒(méi)有顯著性差異（P＞

4、0.05），既有相同條帶，也不同條帶，說(shuō)明健康仔犬的腸道內(nèi)乳桿菌大致相同。②對(duì)照組A在飼喂的9d過(guò)程中，腸道乳桿菌多樣性逐步提高，各重復(fù)個(gè)體共同出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)條帶增多，說(shuō)明芽孢桿菌能增大腸道中乳桿菌多樣性。從聚類圖看出，0d組間相似性66％～88％,3d組間相似性71％～90％，6d組間相似性77％～89％,9d組間相似性62％～74％。說(shuō)明芽孢桿菌具有穩(wěn)定腸道乳桿菌的功能。③攻毒組9d乳桿菌多樣性下降。說(shuō)明沙門桿菌能減少腸道內(nèi)乳桿菌多樣性

5、。從組內(nèi)平均條帶數(shù)來(lái)看，攻毒后條帶平均數(shù)為5.3，與試驗(yàn)0d相比下降了27.4％，與試驗(yàn)3d和6d相比分別下降了39％，35％。④治療組在9d乳桿菌多樣性出現(xiàn)了下降，平均條帶數(shù)為7.3，與試驗(yàn)0d相比，平均條帶數(shù)下降了8％，與試驗(yàn)3d相比下降35.3％，與試驗(yàn)6d相比下降18.9％。由于芽孢桿菌的保護(hù)作用，平均條帶數(shù)多于攻毒組，多樣性下降比例明顯低于攻毒組。說(shuō)明芽孢桿菌能增多腹瀉犬乳桿菌多樣性。
　　 綜上斷奶仔犬腸道乳桿菌多樣