肝硬化大鼠肝移植后腸道細(xì)菌分子生態(tài)結(jié)構(gòu)與血清代謝組學(xué)的研究.pdf

1、原位肝移植術(shù)是治療重型肝炎、肝硬化肝功能失代償?shù)冉K末期肝病最有效的治療手段。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肝移植手術(shù)的成功率不斷提高，術(shù)后生存時(shí)間不斷延長。但是，肝移植術(shù)后各種并發(fā)癥仍然是影響手術(shù)成功的一個(gè)重要因素，其中術(shù)后感染是繼移植排異后的另一常見的并發(fā)癥，發(fā)生率約為47％～80％，病死率達(dá)13％～36％。肝移植術(shù)后感染也是導(dǎo)致移植物慢性失功的重要原因之一，并將增加移植病人住院時(shí)間及醫(yī)療費(fèi)用。肝移植術(shù)后感染的常見病原體包括細(xì)菌(48％)、

2、真菌(22％)、病毒(12％)，以術(shù)后30天內(nèi)發(fā)生的內(nèi)源性感染最為常見，約31％的肝移植患者術(shù)后至少發(fā)生1次由多重耐藥細(xì)菌引起的感染，約69％的病原菌呈多重耐藥。由于肝臟與腸道在解剖結(jié)構(gòu)及功能上有著密切的聯(lián)系，腸道作為人體最大的貯菌所和內(nèi)毒素庫，在特定條件下可以釋放多種毒性物質(zhì)，導(dǎo)致隱匿的內(nèi)源性感染。腸道微生態(tài)失衡、腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加、免疫功能失調(diào)是肝移植感染發(fā)生的重要原因。 本研究重點(diǎn)是肝硬化大鼠在肝移植前后腸道細(xì)菌

3、的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)以及血清代謝譜的變化規(guī)律，旨在探明肝移植后腸道微生態(tài)變化與感染的關(guān)系，尋找與肝移植相關(guān)的特異性代謝靶分子，為進(jìn)一步探索通過重建，優(yōu)化腸道微生態(tài)，減少肝移植后感染的發(fā)生，促進(jìn)移植受者長期健康存活提供新思路和新途徑。 本研究首先建立肝硬化大鼠的肝移植模型，繼而應(yīng)用16SrDNA分子微生態(tài)研究方法和核磁共振法(1HNMR)，對(duì)腸道細(xì)菌組成和血清代謝譜變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，在國內(nèi)外未見類似的報(bào)道。 研究方法：

4、 1.四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)SD大鼠肝硬化模型清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雌雄各半，體重為180g～200g。分為兩組：對(duì)照組10只，造模組40只。模型制備方法：對(duì)照組大鼠無菌腹腔皮下注射花生油溶液；造模組大鼠無菌腹腔皮下注射40％CCL4花生油溶液。于給藥后4周、8周、12周、16周，分別處死2只造模大鼠，取肝，觀察肝臟病理進(jìn)展情況，持續(xù)16周復(fù)制大鼠肝臟病變模型。造模第16周處死造模組大鼠10只和對(duì)照組大

5、鼠5只。剩余的造模組大鼠22只和對(duì)照組大鼠5只肝移植備用。 2.肝硬化SD大鼠肝移植模型的建立選擇清潔級(jí)、體重為250g～300g的SD雄性大鼠19只作為供體；從CCL4造模組剩余的22只SD大鼠中，選擇體重相近的肝硬化大鼠14只，以及造模對(duì)照組剩余的5只SD大鼠作為受體。分為三組：肝硬化肝移植組(正常大鼠.肝硬化大鼠，9只)，肝移植對(duì)照組(正常大鼠-造模對(duì)照組大鼠，5只)，假手術(shù)組(肝硬化大鼠，5只，只打開腹腔便縫合).大鼠原

6、位肝移植模型采用經(jīng)典的Kamada二套袖法。所有的肝移植受體鼠移植前后均不使用抗生素，免疫抑制劑等。 3.標(biāo)本的收集(1)血與糞便：在大鼠CCL4給藥前、CCL4給藥后4周、肝硬化時(shí)/移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集所有大鼠的糞便。除CCIA給藥后4周外、其他的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)采集全血。 (2)下腔靜脈血、肝、脾、腎組織：在肝硬化/肝移植前(造模組10只、對(duì)照組5只)以及肝移植術(shù)后30天(所有19只

7、移植受體鼠)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，收集下腔靜脈血、肝、脾、腎組織。 4.標(biāo)本檢測方法(1)鱟試驗(yàn)法：檢測大鼠血漿內(nèi)毒素水平。 (2)核磁共振法(1H-NMR)：檢測大鼠血清代謝譜。 (3)細(xì)菌需氧與厭氧培養(yǎng)法：取大鼠肝、脾、腎組織，立即研磨，做細(xì)菌需氧與厭氧培養(yǎng)及生化鑒定，分析細(xì)菌易位發(fā)生率及易位細(xì)菌種類。 (4)細(xì)菌熒光定量PCR法：從大鼠糞便抽提總DNA，分別采用腸道六大菌屬(腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、梭

8、菌、雙歧桿菌和乳酸菌)的特異性引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。 (5)聚合酶鏈反應(yīng)，變性梯度凝膠電泳指紋圖譜(PCR-DGGE)分析：用16SrDNAV3區(qū)的通用引物和擬桿菌屬、梭菌屬和雙歧桿菌屬特異性引物作PCR-DGGE指紋圖譜，對(duì)腸道細(xì)菌總體變化趨勢和以上三種菌屬的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析并作克隆測序。 5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，率的統(tǒng)計(jì)用X2檢驗(yàn)，采用MATLAB軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)。

9、 研究結(jié)果： 1.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后細(xì)菌易位情況肝移植術(shù)后30天，大鼠肝、脾、腎細(xì)菌易位率達(dá)66％，遠(yuǎn)高于肝硬化/移植前細(xì)菌易位率(10％)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。細(xì)菌易位部位以肝臟最為常見，脾臟次之，腎臟少見。肝硬化肝移植組的易位細(xì)菌種類以糞腸球菌、銅綠假單孢菌、大腸埃希菌為主，而肝硬化/肝移植前的易位細(xì)菌種類則以銅綠假單孢菌為主。 2.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道細(xì)菌的定量變化采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

10、R方法，選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCIA給藥前、給藥后4周、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天)，動(dòng)態(tài)觀察大鼠糞便中六大優(yōu)勢菌的定量變化。結(jié)果顯示，與肝移植對(duì)照組相比，肝硬化肝移植組在肝硬化發(fā)展過程中，腸道擬桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌數(shù)量不斷下降，肝移植術(shù)后細(xì)菌數(shù)量逐步回升，至肝移植術(shù)后30天基本恢復(fù)至造模前水平。腸道雙歧桿菌屬在肝硬化造模過程中菌量升高，但在肝移植術(shù)后7天開始顯著下降，術(shù)后30天部分恢復(fù)。腸道乳酸菌屬和腸球菌

11、屬在肝硬化造模過程中細(xì)菌含量改變不明顯。 3.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道細(xì)菌總體分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化采用PCR-DGGE方法，借助通用引物，對(duì)腸道所有細(xì)菌的16SrDNAV3區(qū)(可變區(qū))進(jìn)行擴(kuò)增，選擇4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCL4給藥前、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天)，觀察大鼠腸道菌群總體分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)組內(nèi)比較結(jié)果顯示，CCIA給藥前，大鼠腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異小，基本聚成一類；肝硬化/肝移

12、植前，腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異增大，分布彌散，不能聚成一類；至肝移植術(shù)后30天，腸道細(xì)菌的總體分子生態(tài)組成差異減小。(2)組間比較結(jié)果顯示，肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異最大，但與肝移植術(shù)后7天組相比差異不明顯。 4.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后腸道擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化應(yīng)用類群特異性PCR-DGGE方法，進(jìn)一步觀察腸道各優(yōu)勢菌屬(擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬)在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCLA給藥前

13、、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天)的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)組內(nèi)比較結(jié)果顯示，CCIA給藥前，大鼠腸道擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的組內(nèi)分子生態(tài)組成均相似，基本上均聚成一類；CCL4給藥后，上述各菌屬的組內(nèi)分子生態(tài)組成差異均增大，分布彌散。(2)組間比較結(jié)果顯示，擬桿菌屬肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后術(shù)后7天、肝移植術(shù)后術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異均明顯，特別是術(shù)后30天組最為顯著，而術(shù)后7天組與

14、肝硬化/肝移植前組的距離較近；梭菌屬肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組相比差異均明顯，特別是術(shù)后30天組，而在術(shù)后7天組基本恢復(fù)到CCL4給藥前組水平；雙歧桿菌屬肝硬化/肝移植前組與CCL4給藥前組相比差異明顯，分子生態(tài)結(jié)構(gòu)不能聚類，分布在各個(gè)象限，但術(shù)后7天組與術(shù)后30天組相比，能聚集在一起，提示在肝移植術(shù)后，腸道雙歧桿菌屬的組成能較快恢復(fù)穩(wěn)定。 5.肝硬化SD大鼠肝移植術(shù)后血清代謝譜的變化應(yīng)用核磁共振法

15、(1H-NMR)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，選擇4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(CCLA給藥前、肝硬化/肝移植前、肝移植術(shù)后7天、肝移植術(shù)后30天)，動(dòng)態(tài)觀察22只大鼠的血清代謝譜(18種物質(zhì))變化。結(jié)果顯示，大鼠肝硬化/肝移植前，血清乳酸、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、甜菜堿明顯上升，而谷氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白、葡萄糖、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂肪酸、乙酸出現(xiàn)下降。隨著供肝的植入，大鼠血清代謝物的異常逐漸消失，代謝物恢復(fù)正常所

16、需的時(shí)間各不相同。用主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)，CCL4給藥前組、肝硬化/肝移植前組、肝移植術(shù)后7天組的血清代謝譜完全分離，分布在不同的區(qū)域，說明它們的代謝譜完全不同，但肝移植術(shù)后30天組與CCL4給藥前組的血清代謝譜有部分重疊，提示此時(shí)的代謝譜已有部分恢復(fù)。 結(jié)論： 本研究采用系統(tǒng)生物學(xué)方法，對(duì)SD大鼠肝硬化前后、肝移植前后不同時(shí)間點(diǎn)腸道細(xì)菌的分子生態(tài)組成及血清代謝譜進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，證實(shí)大鼠肝移植術(shù)后存在腸道菌群與血清代謝