低氧預適應小鼠海馬、血清代謝組學研究.pdf

1、目的：
　　氧是維持生命活動必不可少的物質，各種原因導致的機體供氧不足或用氧障礙，都可導致缺氧。作為以有氧代謝為主的組織，腦對缺氧的耐受性差，對缺氧極為敏感，急性嚴重缺氧在數(shù)分鐘內即可引起腦神經元的不可逆性損傷甚至死亡，長期慢性缺氧也可引起中樞神經系統(tǒng)的功能紊亂和病理結構改變。因此尋找防治低氧性神經損傷，提高腦對低氧耐受性的措施，對于增強機體適應低氧環(huán)境的能力及防治臨床缺氧性疾病具有重要意義。
　　低氧預適應(hypoxia

2、 preconditioning，HPC)是體內一種內源性保護現(xiàn)象，通過亞致死性低濃度氧反復短暫刺激細胞或組織，使其對隨后更嚴重的缺氧產生耐受，從而產生保護作用，廣泛存在于心、腦、腎、肝、腸等器官中。作為內源性保護機制這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為增強機體適應低氧環(huán)境的能力及防治缺氧性損傷提供了全新的思路。
　　本實驗室既往的研究發(fā)現(xiàn)(1)HPC對小鼠海馬神經元有明顯的保護作用，能顯著提高小鼠的學習記憶能力，證實HPC具有顯著的抗缺氧/缺血神經

3、損傷作用;(2)急性重復低氧預適應發(fā)生發(fā)展過程中隨著小鼠低氧暴露次數(shù)的增加其缺氧耐受時間逐漸延長，重復低氧暴露2次、3次和4次的缺氧耐受時間分別是低氧暴露1次耐受時間的2、4、6倍，推測重復低氧暴露后小鼠體內產生了抗缺氧活性分子，且隨著缺氧次數(shù)的增加，抗缺氧活性分子的數(shù)量也在增加，存在著與藥物作用類似的劑量-效應關系，從而導致小鼠的缺氧耐受時間逐步延長;(3)通過建立急性重復缺氧HPC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HPC組的腦組織勻漿液具有顯著抗缺氧神

4、經損傷作用，其中蛋白組分和非蛋白組分均可以顯著增強神經生長因子（nerve growth factor，NGF）誘導分化的PC12細胞的缺氧耐受性，提示小分子代謝物在其中發(fā)揮重要的作用，但是具體是哪些活性物質在低氧預適應形成過程中發(fā)揮抗缺氧損傷的作用尚不清楚。
　　代謝組學是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量(＜1000KDa)代謝產物同時進行定性和定量分析的一門學科，反映機體對外界刺激、病理生理變化及本身基因突變而產

5、生的體內代謝物水平多元動態(tài)變化。作為各種“組學”的終端，代謝組學更能直接、準確地反應當前機體的病理生理狀態(tài)。
　　本研究的目的在于通過建立急性缺氧HPC小鼠模型，利用超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flightmass spectrometry，UPLC-Q-TOFMS)的代謝組學技術，分離鑒定HPC小鼠與對

6、照組小鼠海馬、血清中差異代謝物，并對部分結果進行驗證，在此基礎上進一步探討機體如何適應缺氧環(huán)境以及HPC潛在的保護機制。
　　方法：
　　第一部分:低氧預適應小鼠海馬代謝組學研究
　　1.60只雄性BALB/C小鼠隨機分為3組，常氧對照組(H0)，低氧暴露1次組(H1)，重復低氧暴露4次組(HPC)，每組20只，;按文獻報道復制急性缺氧HPC小鼠模型，麻醉，斷頭取海馬組織。海馬組織樣本均隨機分為2份，1份用于生化指標測

7、定，一份用于代謝組學分析。代謝組學分析利用UPLC-Q-TOFMS技術結合多變量統(tǒng)計分析篩選各組差異代謝物，MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路富集分析;
　　2.部分代謝組學結果的驗證，分別檢測各組小鼠海馬組織中SOD活性、MDA和乳酸含量。
　　第二部分:低氧預適應小鼠血清代謝組學研究
　　1.按照相同的動物分組和方法復制HPC小鼠模型，麻醉，眼眶采血法取血并分離血清。血清樣本均隨機分為2份，1份用于

8、生化指標測定，一份用于代謝組學分析。代謝組學分析采用UPLC-Q-TOFMS結合多變量統(tǒng)計分析篩選各組小鼠血清差異代謝物，MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路富集分析;
　　2.檢測各組小鼠血清中SOD活性、MDA和乳酸含量，驗證部分代謝組學結果。
　　結果：
　　1.小鼠海馬組織代謝組學研究共鑒定出37種差異代謝物，與H0組相比HPC組中多巴胺、腺苷、苯丙氨酸、?；撬岬却x物顯著上調，5-甲基胞苷、谷氨

9、酸、谷氨酰胺、乙酰膽堿、胞苷、NADH、2-羥戊二酸、尿酸、花生四烯酸、油酸、亞油酸、軟脂酸、溶血磷脂酰膽堿、谷胱甘肽等代謝物在H1組升高，HPC組降低，而色氨酸、鞘氨醇、黃嘌呤則在H1和HPC組均降低。這些代謝物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬岷蛠喤；撬岽x，谷胱甘肽代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，花生四烯酸代謝，亞油酸代謝，酪氨酸代謝，甘油磷脂代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，色氨酸代謝，苯丙氨酸代謝和三羧酸循環(huán)等代謝通路發(fā)生

10、顯著變化;
　　2.HPC組小鼠海馬組織中SOD活性升高，較H0、H1組均有統(tǒng)計學差異;與H0組相比，H1組、HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量均升高，且數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學差異;與H1組相比，HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量顯著降低;
　　3.小鼠血清代謝組學研究共篩選鑒定出25種差異代謝物，其中纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、?；撬嵩贖PC組中顯著升高，長鏈肉毒堿、蛋氨酸、花生四烯酸、溶血磷脂酰膽堿、尿酸相對含量

11、在H1組中升高HPC組中降低，這些代謝物涉及的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬帷喤；撬岽x，亞油酸代謝，花生四烯酸代謝等代謝通路均發(fā)生顯著變化;
　　4.與H0組相比，H1組和HPC組小鼠血清中SOD活性均升高，且HPC組最高，每兩組之間數(shù)據(jù)比較均有統(tǒng)計學差異;與H0組相比，H1組、HPC組小鼠血清中MDA和乳酸含量均升高，且數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學差異;與H1組相比，HPC組小鼠海馬組織中MDA和乳酸含量顯著降低。
　　結論：

12、
　　1.HPC小鼠血清、海馬組織代謝模式發(fā)生顯著改變，其中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成，?；撬帷喤；撬岽x，花生四烯酸代謝，亞油酸代謝，苯丙氨酸代謝，酪氨酸代謝通路為共同發(fā)生改變的代謝通路，谷胱甘肽代謝，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝僅在海馬組織中有顯著變化，上調（抑制）其中的關鍵代謝酶或許能提高全身或中樞神經系統(tǒng)抗缺氧損傷能力;
　　2.代謝組學數(shù)據(jù)中與清除氧化自由基有關的物質谷胱甘肽、尿酸等代謝物變化和小鼠海馬組織和血