基于多種分析技術的胰腺癌與糖尿病血清代謝組學研究.pdf

1、胰腺癌（Pancreatic cancer）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占人類全身腫瘤的1-3％，在西方國家居惡性腫瘤死亡原因的第四位，早期診斷困難。胰腺癌與糖尿病有著密切關系，探索兩者發(fā)病機制的聯(lián)系，將有助于了解胰腺癌的病因，并為提高癌癥早期診斷率提供依據(jù)。代謝組學從系統(tǒng)水平研究機體小分子代謝產物變化規(guī)律，在研究疾病發(fā)病機制和早期診斷等方面有一定優(yōu)勢。本論文將加壓毛細管電色譜（pCEC）應用于血漿代謝組學研究，證明了該技術高

2、效分離血漿內源性代謝物的能力，以及作為胰腺癌早期診斷手段的可行性。進一步分別應用以UPLC/MS和GC/MS為基礎的代謝組學技術，從整體上考察胰腺癌、糖尿病和正常人血清間的代謝物差異，發(fā)現(xiàn)可獲得較多兩種疾病間共有和特異性的標志物，為將來全面理解兩種疾病在發(fā)病機制上的差異和聯(lián)系提供了一個新視角和實驗基礎。同時，根據(jù)代謝組學數(shù)據(jù)具有非線性的特點，探討了非線性人工神經網(wǎng)絡對三組樣本進行分類的能力，說明該技術有潛力用于大樣本量的模式識別。

3、>　　本論文主要內容包括：
　　1、建立pCEC研究血漿代謝指紋圖譜的方法，考察該方法區(qū)分胰腺癌患者的能力。以反相色譜柱和梯度洗脫對血漿樣品進行pCEC分離。通過考察流動相組成、檢測波長、酸改性劑和操作電壓對質控（QC）血漿樣品分離情況的影響優(yōu)化色譜條件。通過對重復進樣的QC樣品進行考察，說明該方法重復性好、系統(tǒng)穩(wěn)定性高。另外，比較了pCEC-UV數(shù)據(jù)經不同標準化方法預處理后，對正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型的影響。

4、研究發(fā)現(xiàn)，pCEC-UV分析得到的血漿代謝指紋圖譜能明顯表征出胰腺癌患者和正常人的代謝表型差異，結合有監(jiān)督模式識別，能夠有效的區(qū)分胰腺癌患者和健康對照組的血漿代謝輪廓。本研究說明pCEC-UV技術可以作為一種經濟環(huán)保、高效和相對簡單的技術平臺用于疾病的血漿代謝譜研究，是一種潛在的早期診斷手段。
　　2、采用超高壓液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜（UPLC Q-TOF MS）技術分析了20個胰腺癌患者、19個2型糖尿病患者和25個正

5、常人血清的代謝組學差異，結合非監(jiān)督的PCA方法，發(fā)現(xiàn)三組樣本的代謝譜有分離趨勢。進一步利用有監(jiān)督的OPLS-DA方法能清楚地將三組樣本分開，說明相對于正常人而言，胰腺癌患者和糖尿病人的代謝譜均發(fā)生改變，并有明顯差異。根據(jù)精確分子量、同位素信息和MS/MS信息，按照差異代謝物的種類，對其進行了系統(tǒng)的鑒定，尤其是對血清中檢測到的溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）的同分異構體進行了全面鑒定。與正常人相比，胰腺癌患者血清中以甘氨鵝脫氧膽酸為代表的4

6、種膽汁酸明顯升高，12種lysoPC（包括部分同分異構體）降低，花生四烯酸以及部分脂肪酸升高；糖尿病患者血清中同樣的12種lysoPC顯著降低，而花生四烯酸等游離脂肪酸降低。胰腺癌與糖尿病在磷脂代謝和脂肪酸代謝均發(fā)生了紊亂，但是lysoPC18:1同分異構體的比例變化在兩種疾病中存在差異，提示將來通過對具體種類的lysoPC同分異構體進行定量分析可能會發(fā)現(xiàn)胰腺癌與糖尿病的特異性差異標志物。
　　3、采用氣相色譜質譜（GC-MS）技

7、術分析了20個胰腺癌患者、19個2型糖尿病患者和25個正常人血清的代謝組學差異。以N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）為衍生試劑，采用兩步法對血清樣品進行衍生，同時優(yōu)化了甲氧胺的加入量。結合PCA和OPLS-DA對數(shù)據(jù)進行模式識別，得到了與UPLC-MS代謝組學分析類似的結果，能夠清晰的區(qū)分三組樣本的血清代謝組差異。實驗檢測得到的差異物與UPLC-MS互補，主要為氨基酸類、糖類、膽固醇以及有機酸等物質。與正常人相比，胰腺癌與糖

8、尿病患者的糖代謝、糖酵解以及部分氨基酸代謝均發(fā)生了不同程度的紊亂。亮氨酸、十六烷酸以及苯丙氨酸在胰腺癌組特異性上調，甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸、檸檬酸則在糖尿病患者血清中特異性下調，提示這些小分子物質可能分別為兩種疾病的潛在特異性生物標志物。
　　4、以UPLC/MS實驗得到的26個差異物在各個樣本中的響應強度為數(shù)據(jù)基礎，采用非線性人工神經網(wǎng)絡建立多類型樣本的分類模型。通過試驗比較不同隱含層數(shù)和隱含層結點數(shù)對網(wǎng)絡收斂性及血清