EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因突變對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響.pdf

1、研究背景：
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種跨膜糖蛋白，是蛋白激酶超家族的成員之一。該蛋白作為表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowth factor，EGF)家族成員的受體，能夠與EGF等配基相結(jié)合并激活下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在眾多EGFR細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，KRAS/RAF/MEK/ERK以及P13K/AKI通路是其中最重要的兩條通路。正常情況下

2、EGF等配基與受體的結(jié)合可引起受體的二聚化以及酪氨酸的自體磷酸化，并主要通過以上兩條通路最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷徙、存活以及血管形成等生命活動(dòng)。
　　 EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由于在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，因而成為分子靶向治療的重要靶點(diǎn)，針對(duì)EGFR及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)生物分子的研究及藥物開發(fā)已成為研究熱點(diǎn)。在結(jié)直腸癌分子靶向治療方面，最具代表性的藥物當(dāng)屬抗EGFR單克隆抗體(單抗)，如西妥昔單抗和帕尼單抗。研究表

3、明，KRAS基因在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及加速其增殖方面起著重要的作用。通過抗EGFR單抗的臨床應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)KRAS基因狀態(tài)是預(yù)測(cè)抗EGFR單克隆抗體療效的有效指標(biāo)。相關(guān)研究表明KRAS基因的突變能引起抗EGFR單抗治療失敗。近年來完成的多項(xiàng)Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)證明，在使用抗EGFR單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時(shí)，只有KRAS基因?yàn)橐吧偷幕颊卟拍軓闹委熤惺芤?。?duì)此，美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)認(rèn)為，所有準(zhǔn)備接受抗EGFR單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，在接受

4、治療前都應(yīng)當(dāng)接受KRAS基因狀態(tài)的檢測(cè)，抗EGFR.單抗靶向治療的對(duì)象應(yīng)限制為野生型KRAS基因的結(jié)直腸癌患者。然而多數(shù)臨床實(shí)踐表明，在接受抗EGFR靶向治療的野生型KRAS基因患者中，并非全部病人可從此項(xiàng)治療中獲益，仍然有相當(dāng)一部分病例治療無(wú)效。這提示僅僅依據(jù)KRAS基因狀態(tài)不能很好地預(yù)測(cè)抗EGFR單抗靶向治療的療效，據(jù)此篩選抗EGFR單抗治療的目標(biāo)人群不可能完全準(zhǔn)確。除了病人腫瘤組織的KRAS基因狀態(tài)外，可能還存在其他因素決定著EG

5、FR靶向治療的療效，如EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其它基因的突變狀態(tài)等。因此，如何通過臨床特征、病理特征以及基因突變方面的研究預(yù)測(cè)抗EGFR治療的療效并篩選治療對(duì)象，是抗EGFR單抗用于臨床后受到廣泛關(guān)注并迫切需要解決的臨床問題。
　　 目前臨床上在對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者KRAS基因狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)以預(yù)測(cè)EGFR靶向治療療效時(shí)并未對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶加以甄別，由于惡性腫瘤具有明顯的異質(zhì)性，可能存在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶基因型不一致的情況。腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致

6、基因型或基因表達(dá)產(chǎn)物的不一致，早已被研究者關(guān)注。Italiano采用免疫組化和FISH方法研究非小細(xì)胞肺癌EGFR蛋白表達(dá)及基因狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的不一致。Kalikaki在對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR和KRAS基因狀態(tài)在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間并不一致。Oliveira的研究顯示，結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的KRAS突變頻率較原發(fā)灶的高，這些結(jié)果提示僅以原發(fā)灶基因狀態(tài)推斷轉(zhuǎn)移灶的情況并不完全準(zhǔn)確。肝臟是結(jié)直腸癌最常見的轉(zhuǎn)移靶器官，據(jù)

7、統(tǒng)計(jì)，約20％的初治病人伴有肝轉(zhuǎn)移，50％的病人在治療過程中出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，70％的尸解病例發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的最重要致死因?yàn)椋彩桥R床工作中的治療重點(diǎn)。由于KRAS基因狀態(tài)影響著轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌抗EGFR單抗治療的療效，因此了解結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶KRAS基因狀態(tài)是否有一致性就顯得尤為重要。
　　 用于KRAS基因突變的檢測(cè)方法主要包括：PCR-SSCP測(cè)序(single strandconformation poly

8、morphism analysis)、KRAS突變體富集PCR測(cè)序法(mutant-enriched PCR coupled sequencing)、焦磷酸突變體測(cè)序法(pyrosequencing)、雙脫氧序列測(cè)定(dideoxy sequencing)、實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitative PCR)和PCR斑點(diǎn)雜交法(PCR-dot blot hybridization)等。不同檢測(cè)方法的敏感度不一樣，可能造成

9、檢測(cè)結(jié)果的差異。Whitehall的研究顯示，在將樣本DNA進(jìn)行統(tǒng)一提取的情況下，采用6種不同檢測(cè)方法得到KRAS突變頻率最低的為32.9％，最高的達(dá)59.5％，雖然排除了所有6種方法在DNA提取過程的差異，仍然只有62.2％(46/74)的樣本測(cè)試結(jié)果是一致的。除了方法學(xué)差異外，DNA質(zhì)量和樣本中腫瘤細(xì)胞的相對(duì)含量也是決定檢測(cè)結(jié)果的重要因素，以上這些因素在基因突變檢測(cè)工作中應(yīng)加以重視。
　　 根據(jù)已有的研究成果和存在問題，本研

10、究設(shè)計(jì)以下內(nèi)容：(1)通過同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者EGFR，KRAS，BRAF和PIK3CA基因的突變狀態(tài)，了解中國(guó)患者人群中這些基因突變的頻率，以及其對(duì)未接受靶向治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者生存情況的預(yù)測(cè)價(jià)值。(2)為了解轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶KRAS基因突變狀態(tài)的差異，進(jìn)行結(jié)直腸癌原發(fā)灶與相應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移灶KRAS基因突變狀態(tài)的研究，并進(jìn)一步探討腫瘤的異質(zhì)性對(duì)EGFR靶向治療可能造成的影響。(3)為了解不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果的影響，對(duì)本研究中使用的K

11、RAS突變體富集PCR測(cè)序法和焦磷酸突變體測(cè)序法進(jìn)行了初步的對(duì)比研究。期望通過以上這些研究，為中國(guó)人群結(jié)直腸癌患者的EGFR靶向治療及個(gè)體化治療提供參考資料。
　　 研究方法
　　 1.EGFR、KRAS、BRAF及PIK3CA突變頻率的檢測(cè)
　　 從2030位結(jié)直腸癌患者中篩選出61例隨訪資料完整的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，提取出其病理樣本中的DNA，并設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR方法將EGFR、KRAS、BRAF、PIK3

12、CA基因最常見的突變所在外顯子擴(kuò)增。采用焦磷酸測(cè)序儀配套的單鏈純化裝置從PCR反應(yīng)液中分離單鏈DNA；將測(cè)序反應(yīng)板放置于測(cè)序儀中進(jìn)行測(cè)序。然后采用焦磷酸測(cè)序儀配套的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，首先進(jìn)行SNP分析，對(duì)于存在雜合子的位點(diǎn)，需進(jìn)一步進(jìn)行基因頻率(AQ)分析，從而檢測(cè)出61例樣本中四種基因各自的突變率。
　　 2.臨床病理學(xué)參數(shù)及基因突變對(duì)患者生存率的預(yù)后價(jià)值
　　 應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析

13、總生存率與KRAS、BRAF及PIK3CA基因突變狀態(tài)、年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移灶數(shù)目以及治療方案等變量之間的單變量關(guān)系，同時(shí)應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估KRAS、BRAF及PIK3CA基因突變對(duì)生存情況的預(yù)后意義，以及經(jīng)過對(duì)年齡、性別、腫瘤原發(fā)灶部位、轉(zhuǎn)移灶部位、轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和治療方案等因素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后的預(yù)后意義。
　　 3.結(jié)直腸癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶KRAS基因狀態(tài)的研究
　　 收集手術(shù)切除及活檢所

14、得的結(jié)直腸癌原發(fā)灶及其肝轉(zhuǎn)移灶的腫瘤標(biāo)本46例，從每個(gè)標(biāo)本中切取10張10μm的切片，對(duì)切片中腫瘤部位進(jìn)行標(biāo)記，顯微切割分離出已標(biāo)記好的腫瘤組織，提取出樣本中的DNA，并設(shè)計(jì)引物，采用突變體富集PCR測(cè)序法檢測(cè)KRAS基因中12、13號(hào)密碼子的突變狀態(tài)，從而分析比較原發(fā)灶樣本及相應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶樣本中KRAS基因突變情況的差異。
　　 4.兩種KRAS基因檢測(cè)方法的比較研究
　　 選擇腫瘤樣本量充足且經(jīng)過突變體富集PCR測(cè)序法

15、檢測(cè)的13例樣本，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序法對(duì)比檢測(cè)，初步觀察兩種不同的檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果的影響；兩種檢測(cè)方法所采用的標(biāo)本收集過程略有不同，突變體富集配對(duì)PCR測(cè)序法檢測(cè)的樣本使用顯微切割技術(shù)進(jìn)行收集，與焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)的樣本相比有較高的腫瘤細(xì)胞含量。
　　 研究結(jié)論
　　 1.EGFR的19和21號(hào)外顯子上未檢測(cè)到突變，與國(guó)外報(bào)道相符。而采用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)所得結(jié)果顯示KRAS、BRAF和PIK3CA基因較國(guó)外報(bào)道的突變頻率低，提示

16、中國(guó)人群中可能有更多的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者適合接受抗EGFR單抗靶向治療。與此同時(shí)，也不能排除檢測(cè)方法和標(biāo)本處理對(duì)結(jié)果的影響。盡管EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中這四個(gè)基因突變對(duì)于未接受EGFR靶向治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者而言，可能并非是重要的預(yù)后標(biāo)志，但檢測(cè)基因突變對(duì)于選擇接受EGFR靶向治療的患者而言，卻具有非常重要的意義。
　　 2.EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的KRAS、BRAF和PIK3CA基因突變狀態(tài)與患者的預(yù)后無(wú)顯著的相關(guān)性。即使應(yīng)

17、用多變量分析的方法將其他可能的影響因素標(biāo)準(zhǔn)化后，仍然得出相同的結(jié)果。單因素分析顯示在各項(xiàng)臨床病理參數(shù)及基因突變狀態(tài)中，年齡、轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和治療方案與預(yù)后具有很好的相關(guān)性，年齡高于65歲、轉(zhuǎn)移灶數(shù)量少以及接受多學(xué)科綜合治療的患者有較好的預(yù)后。
　　 3.通過檢測(cè)結(jié)直腸癌原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因突變狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中KRAS基因狀態(tài)并不完全一致，但原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶KRAS基因狀況的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果表明KRAS