RAS-RAF-PI3K信號通路基因突變及20q擴增與結(jié)直腸癌患者臨床病理學特征、轉(zhuǎn)移及預后相關性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率在世界惡性腫瘤中排名第三位，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因之一。多種遺傳學的改變在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，最重要的改變包括RAS-RAF/PI3K通路相關基因的體細胞突變和20q染色體擴增。RAS-RAF/PI3K通路相關基因突變不僅提示患者對抗EGFR的靶向藥物耐藥，而且與臨床病理特征、轉(zhuǎn)移和預后密切相關。此外，20號染色體長臂(20q)顯著擴增的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的

2、風險要明顯高于其他患者。
　　上述研究數(shù)據(jù)多數(shù)來源于西方患者，僅有幾篇文獻報道過中國人群中RAS-RAF/PI3K通路中KRAS2號外顯子、BRAF和PIK3CA等頻率較高的基因突變，關于KRAS3、4號外顯子和NRAS等頻率較低的基因突變僅見一篇報道。因此，本研究旨在中國結(jié)直腸癌患者中檢測RAS-RAF/PI3K通路相關基因的主要突變區(qū)，包括KRAS外顯子2、3、4，NR4S外顯子2和3、BRAF以及PIK3CA基因，以明確其突

3、變頻率和突變類型的分布。同時設計多個位于20q的BAC探針，結(jié)合iFISH技術了解原發(fā)灶中20q的擴增狀態(tài)，并將上述數(shù)據(jù)結(jié)合患者的臨床病理特征和隨訪資料進行綜合分析。為中國結(jié)直腸癌患者靶向藥物的選擇及肝轉(zhuǎn)移早期診斷提供重要依據(jù)。
　　收集東南大學附屬中大醫(yī)院和東南大學附屬江陰市人民醫(yī)院2007年-2012年共353例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶石蠟標本，所有患者均有完整的臨床病理及隨訪資料。提取腫瘤組織基因組DNA，采用PCR-直接測序的

4、方法檢測KRAS基因的2、3、4外顯子，NRAS2和3外顯子，BRAF15外顯子和PIK3CA的9、20外顯子，綜合分析所有突變與患者臨床病理、術后遠處轉(zhuǎn)移及生存狀況之間的關系。獲得主要結(jié)果如下:
　　1.結(jié)直腸癌患者中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的突變頻率依次為52.7％、3.4％、4.5％和13.1％，其中KRAS2號外顯子之外的RAS基因的突變頻率可達到14％。
　　2.NRAS突變在女性患者中出現(xiàn)的頻率

5、高于男性患者(75％ vs25％，p=0.019);BRAF突變顯示與不良的原發(fā)灶病理分級(p=0.003)、高TNM分期(p=0.001)、較深的原發(fā)灶浸潤程度(p=0.019)相關;同時，BRAF突變的患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.004)、術前和術后轉(zhuǎn)移（術前轉(zhuǎn)移:p=0.002;術后轉(zhuǎn)移:p=0.016）的風險增高;PIK3CA基因突變頻率在結(jié)腸癌患者中升高(p=0.014)。
　　3.KRAS2號外顯子突變患者的平均年齡高

6、于野生型患者（67歲vs64歲，p=0.036），此類患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險也顯著高于后者(52.3％ vs41.6％，p=0.046)。KRAS3號外顯子突變與低TNM分期(p=0.011)、較淺的原發(fā)灶浸潤程度(p=0.001)相關。
　　4.BRAF突變與患者總體生存率降低顯示出強相關性(p＜0.001)，攜帶PIK3CA和NRAS突變的Ⅰ-Ⅲ期結(jié)直腸癌患者發(fā)生術后遠處轉(zhuǎn)移的風險顯著增加(p=0.033;p=0.017)，

7、并能分別作為提示患者遠處轉(zhuǎn)移的獨立指標（PIK3CA: HR=3.129，p=0.003; NRAS: HR=5.152,p=0.003）。
　　本實驗室前期已經(jīng)挑選出40例未轉(zhuǎn)移和6例肝轉(zhuǎn)移的樣本，并成功進行iFISH雜交和探針計數(shù)。本研究將肝轉(zhuǎn)移患者增加到10例，另增加11例肝外轉(zhuǎn)移的患者。根據(jù)我們設計的3個20q染色體的BAC克隆探針，結(jié)合iFISH(間期熒光原位雜交)技術直接檢測每個標本單個腫瘤細胞中20q的擴增狀態(tài)。繪制

8、ROC曲線并設定的臨界值，根據(jù)臨界值分組分析20q擴增與患者臨床病理特征、生存及肝轉(zhuǎn)移間的相關性。獲得主要結(jié)果:在腫瘤腺體中，實驗探針信號明顯多于參照探針，三個實驗探針的均值與參照探針之間存在明顯的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。由于三個實驗探針分別雜交20q的上部、中部和尾部，說明結(jié)直腸癌中20q擴增的片段可能橫跨20q12到20qter的區(qū)域，3.20q13.2/20p12探針最適合評價腫瘤腺體20q的擴增情況。由于樣本量小，尚未發(fā)現(xiàn)2

9、0q擴增狀態(tài)與患者臨床病理特征、預后及肝轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計學相關性。
　　日前我國開始著手準備精準醫(yī)學計劃，并已公布第一批腫瘤診斷與治療項目高通量基因測序技術的臨床應用試點單位，旨在通過基因?qū)用娓_的指導腫瘤治療和預測生存。我們的研究數(shù)據(jù)為預測抗EGFR靶向藥物的有效性提供了重要依據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)RAS-RAF/PI3K信號通路相關基因的總突變頻率高達62.3％，說明可能有過半的患者并不能真正從靶向治療中獲益。當患者在未進行基因檢測的情