PI3K-RAS-RAF突變及20q擴(kuò)增狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征、預(yù)后及肝轉(zhuǎn)移間的相關(guān)性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是西方國(guó)家同時(shí)也是我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤。遺傳及表觀(guān)遺傳變異的累積導(dǎo)致了結(jié)直腸癌的發(fā)生，其中最為常見(jiàn)的遺傳改變?yōu)镵RAS、BRAF和PIK3CA的基因突變。在西方結(jié)直腸癌患者中，它們的突變頻率已明確，對(duì)于它們與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性也有深入研究。其中KRAS的基因型被認(rèn)為可指導(dǎo)患者對(duì)靶向藥物的使用，BRAF的突變提示患者預(yù)后不良，而這些提示意義在中國(guó)結(jié)直腸癌患者中尚未明確。同時(shí)在西方患者的研究中發(fā)現(xiàn)攜帶20號(hào)染色體長(zhǎng)臂(2

2、0q)顯著擴(kuò)增但無(wú)上述基因突變的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移率(61％)要明顯高于其他患者，提示聯(lián)合檢測(cè)基因突變和20q可以預(yù)測(cè)肝轉(zhuǎn)移。
　　本研究擬在中國(guó)結(jié)直腸癌患者中，明確基因突變及20q擴(kuò)增的狀況，探討它們與臨床病理特征、預(yù)后及肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為實(shí)現(xiàn)中國(guó)結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療及肝轉(zhuǎn)移早期診斷提供重要的理論依據(jù)。
　　第一部分采用隊(duì)列研究，旨在明確中國(guó)結(jié)直腸癌患者中KRAS、BRAF和PIK3CA的基因突變頻率及其與臨床病理特征及預(yù)

3、后間的相關(guān)性。我們?cè)跂|南大學(xué)附屬中大醫(yī)院2007年-2012年實(shí)施結(jié)直腸癌原發(fā)灶切除術(shù)的患者中收集了214例患者的腫瘤標(biāo)本，所有患者均有完整的臨床病理及預(yù)后資料（患者中位隨訪(fǎng)時(shí)間為34個(gè)月）。所有標(biāo)本均通過(guò)中性甲醛固定、石蠟包埋、切片，HE染色后由病理醫(yī)師復(fù)閱切片確定腫瘤細(xì)胞≥50％區(qū)域后進(jìn)行切割富集腫瘤細(xì)胞提取DNA。我們采用PCR-直接測(cè)序的方法檢測(cè)了KRAS基因的2外顯子、BRAF基因的15號(hào)外顯子和PIK3CA基因的9號(hào)和20號(hào)

4、外顯子。采用x2檢驗(yàn)（Fisher's精確概率法）、t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)分析上述三個(gè)基因的基因型與患者臨床病理特征間的關(guān)系。Kaplan-Meier檢驗(yàn)用于生存分析，Log-rank檢驗(yàn)用于比較兩組間生存狀況，并用多因素COX回歸分析進(jìn)行多因素分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS18.0完成，主要結(jié)果如下:
　?、俳Y(jié)直腸癌患者中KRAS，BRAF和PIK3 CA的突變頻率依次為44.9％(96/214)，4.2％(9/214)和12.2

5、6％(26/212)。這三個(gè)基因中最常見(jiàn)的三種突變?yōu)镚12D，V600E和H1047R;②絕大多數(shù)BRAF和PIK3CA突變均發(fā)生在結(jié)腸癌患者中，且BRAF突變出現(xiàn)在右半結(jié)腸中;③BRAF600位密碼子的突變與結(jié)腸癌患者的高TNM分期(p＜0.001)和總體生存下降相關(guān)(p＜0.000)，并能作為提示患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)(HR=4.154，p=0.004));④與KRAS wt/BRAF wt患者(N=205)相比，KRAS13位密碼

6、子(N=25)突變與總體生存下降相關(guān)(p=0.016)，并能作為提示患者預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)(HR=2.681，p=0.011)，而KRAS12位密碼子突變沒(méi)有該提示作用，并且在KRAS13位密碼子突變中，c.38G＞A(p.G13D，N=23;HR=2.648，p=0.016)最能顯示出與患者預(yù)后不良的相關(guān)性。
　　第二部分主要采用病例-對(duì)照研究，探索20q擴(kuò)增的狀況與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征、預(yù)后及肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。我們?cè)跂|南大學(xué)

7、附屬中大醫(yī)院2007-2012實(shí)施結(jié)直腸癌手術(shù)的患者中收集了46例患者的腫瘤標(biāo)本，其中39例未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，7例發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移。綜合全基因組的分析數(shù)據(jù)（包括aCGH和SNP），我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)對(duì)應(yīng)于20q染色體的BAC克隆探針作為實(shí)驗(yàn)探針及1個(gè)位于20p的參照探針，并成功應(yīng)用了iFISH(間期熒光原位雜交)技術(shù)直接觀(guān)測(cè)原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞中20q的擴(kuò)增狀態(tài)。該技術(shù)在國(guó)內(nèi)結(jié)直腸癌石蠟組織中尚未開(kāi)展。采用x2檢驗(yàn)(Fisher's精確概率法)、t檢驗(yàn)

8、及秩和檢驗(yàn)分析探針之間、20q擴(kuò)增狀態(tài)與患者臨床病理特征及預(yù)后轉(zhuǎn)移間的關(guān)系。Kaplan-Meier檢驗(yàn)用于生存分析，Log-rank檢驗(yàn)用于比較兩組間生存狀況。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS18.0完成，主要結(jié)果如下:
　　①腫瘤組織中普遍存在20號(hào)染色體的不穩(wěn)定，這3個(gè)探針對(duì)應(yīng)的20q的DNA片段在結(jié)直腸癌患者的腫瘤腺體細(xì)胞中均有擴(kuò)增;②由于3個(gè)探針?lè)稚⒃?0號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，其對(duì)應(yīng)的DNA片段間沒(méi)有顯示擴(kuò)增差異，提示擴(kuò)增區(qū)域是跨

9、越20q12到20qter整個(gè)片段的擴(kuò)增;③我們尚未發(fā)現(xiàn)20q的擴(kuò)增狀態(tài)與患者臨床病理特征、預(yù)后及轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。目前的相關(guān)性分析結(jié)果在很大程度上受到了樣本量的限制，在今后的實(shí)驗(yàn)中將擴(kuò)大樣本量，尤其是肝轉(zhuǎn)移組。
　　綜上所述，我們的研究表明PI3K/RAS-RAF信號(hào)通路的基因突變?cè)谥袊?guó)結(jié)直腸癌患者中普遍存在，但具有一些與西方患者不同的特點(diǎn)。在目前我們所搜集的患者中，我們證實(shí)了BRAF600位密碼子的突變可作為中國(guó)結(jié)腸癌患