散發(fā)性結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)及其與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)居癌癥發(fā)病率第五位;隨著生活水平提高和生活方式及飲食習(xí)慣的西化，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢(shì)。2007年上海市惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率，結(jié)直腸癌男性排名第三位，女性排名已至第二位。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多基因參與的過(guò)程，傳統(tǒng)的遺傳學(xué)改變和表觀遺傳修飾共同參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。具有分子遺傳背景的結(jié)直腸癌約占25％，75％為散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorecta

2、lcancer，SCRC)，其發(fā)生機(jī)制頗為復(fù)雜。目前認(rèn)為染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability，CIN)以及癌基因和抑癌基因的變異和DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair， MMR)功能缺失導(dǎo)致的廣泛微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)是導(dǎo)致大腸癌發(fā)生的兩大主要基因途徑。MSI的檢測(cè)也具有臨床意義，MSI狀態(tài)與SCRC的預(yù)后以及腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)。傳統(tǒng)的MSI

3、分子生物學(xué)檢測(cè)方法需要相應(yīng)的設(shè)備和人員，費(fèi)用昂貴，耗時(shí)較長(zhǎng)。盡管MMR蛋白缺失狀況可以反映腫瘤的MSI狀態(tài)，但因?yàn)闄z測(cè)指標(biāo)不統(tǒng)一，其敏感性和特異性需要進(jìn)一步論證，MMR蛋白缺失與SCRC預(yù)后的相關(guān)性也需要進(jìn)一步證實(shí)。故本課題對(duì)上述問(wèn)題分別報(bào)告如下:
　　第一部分散發(fā)性結(jié)直腸癌錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性研究
　　目的：在散發(fā)性結(jié)直腸癌(SCRC)中，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemist

4、ry，IHC)的方法評(píng)價(jià)4個(gè)錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)基因hMLH1、hPMS2、hMSH2和hMSH6編碼的蛋白表達(dá)情況，分析錯(cuò)配修復(fù)蛋白(mismatch repairprotein，MMRP)表達(dá)情況與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，并探討MMRP表達(dá)與SCRC患者預(yù)后的關(guān)系。
　　材料與方法：
　　1、收集2007年1月-2009年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受診治的452例SCRC患者的石蠟包埋組織

5、。
　　2、運(yùn)用全自動(dòng)免疫組化方法檢測(cè)癌組織中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表達(dá)情況。四個(gè)MMRP中只要一個(gè)表達(dá)缺失即定義為錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失(mismatch repair protein defect，MMR-D)，四個(gè)MMRP均無(wú)表達(dá)缺失定義為錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)正常(mismatch repair protein intact，MMR-I)。
　　3、收集452例SCRC患者的年齡、性別等臨床病理資料，通過(guò)住

6、院病例查詢、電話、門(mén)診隨訪獲得散發(fā)性結(jié)直腸癌患者隨訪資料，生存數(shù)據(jù)為總生存(overall survival，OS)和無(wú)病生存(disease-free survival, DFS)時(shí)間，分析MMRP表達(dá)情況與SCRC的臨床病理參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、IHC檢測(cè)結(jié)果:452例SCRC中，43例MMRP表達(dá)缺失(MMR-D)，缺失率為9.51％。其中，29例MLH1表達(dá)缺失，29例PMS2表達(dá)缺失，5例MSH

7、2表達(dá)缺失，11例MSH6表達(dá)缺失;MLH1、PMS2共同缺失25例，MSH2、MSH6共同缺失4例;1例四個(gè)MMRP均缺失。
　　2、MMR-D結(jié)直腸癌臨床病理特征:右半結(jié)腸癌MMRP表達(dá)缺失率顯著高于左半結(jié)腸癌和直腸癌(P＜0.05);MMR-D組腫瘤平均最大徑為6.32cm，MMR-I組腫瘤平均最大徑為4.27cm，腫瘤最大徑＞5cm者M(jìn)MRP表達(dá)缺失率顯著高于腫瘤最大徑≤5cm者(P＜0.05);低分化者較多發(fā)生MMRP缺

8、失表達(dá)(P＜0.05)，而未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)患者較發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)患者發(fā)生MMRP缺失表達(dá)的幾率顯著提高(P＜0.05)。MMRP表達(dá)情況與患者年齡、性別、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及臨床病理分期無(wú)顯著相關(guān)性。
　　3、生存分析
　　(1)452例SCRC中具有完整隨訪資料者442例，失訪10例。442例SCRC的無(wú)病生存率和總生存率分別為70.8％(313/442)、78.5％(347/442)。局部復(fù)發(fā)

9、率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率、病死率分別為14.5％(64/442)、25.3％(112/442)、21.5％(95/442)。
　　(2) MMR-D組43例中有1例失訪;6例術(shù)后局部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率14.3％;發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例，其中3例肝轉(zhuǎn)移，1例骨轉(zhuǎn)移，1例全身廣泛轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率11.9％;死亡3例，病死率7.1％。MMR-I組409例，有9例失訪。58例局部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率14.5％，與MMR-D組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;轉(zhuǎn)移107例，轉(zhuǎn)移率26.

10、8％，死亡92例，病死率23％，顯著高于MMR-D組(P＜0.05)
　　(3)Kaplan-Meier單因素生存分析顯示MMR-D組總生存(OS)率顯著優(yōu)于MMR-I組(P＜0.05)，無(wú)病生存率也較MMR-I組高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示MMRP表達(dá)是SCRC總生存率獨(dú)立的預(yù)后因素(P＜0.05)。
　　第二部分散發(fā)性結(jié)直腸癌微衛(wèi)星狀態(tài)與錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的對(duì)照性研究
　　目的：

11、應(yīng)用多重?zé)晒釶CR(polymerase chain reaction)-毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)SCRC的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)狀態(tài)，將檢測(cè)結(jié)果與MMRP的IHC檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，探討IHC檢測(cè)MMRP表達(dá)的方法篩選MSI表型SCRC患者的敏感性和特異性，以評(píng)價(jià)其臨床實(shí)際應(yīng)用的可行性。
　　材料與方法：
　　1、根據(jù)第一部分中IHC檢測(cè)結(jié)果，選取43例MMR-D及101例MMR-I病例，分別收集兩組病例的腫瘤和相應(yīng)的正常結(jié)直

12、腸組織，均為常規(guī)石蠟包埋組織。
　　2、分別提取腫瘤和相應(yīng)的正常結(jié)直腸組織的DNA。
　　3、采用多重?zé)晒釶CR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)兩組病例的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微衛(wèi)星位點(diǎn)(BAT25，BAT26，D2S123，D5S346，D17S250)的MSI狀態(tài)，以Genemapper軟件分析PCR產(chǎn)物并判斷腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)。5個(gè)位點(diǎn)中至少2個(gè)位點(diǎn)有重復(fù)序列長(zhǎng)度變化定義為高頻MSI(High level of microsatellite inst

13、ability，MSI-H)，只有一個(gè)位點(diǎn)有長(zhǎng)度變化定義為低頻MSI(Low level of microsatelliteinstability，MSI-L)，無(wú)任何位點(diǎn)的變化定義為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellitestability，MSS)。
　　結(jié)果：
　　1、PCR檢測(cè)結(jié)果:受檢的144例SCRC中，41例為MSI-H，3例為MSI-L，100例為MSS。MMR-D組43例中，MSI-H37例，MSI-L1例

14、，MSS5例;MMR-I組101例中， MSI-H4例， MSI-L2例，MSS95例。
　　2、IHC檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)照分析:兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合率為93.1％(134/144)，一致性檢驗(yàn)結(jié)果kappa值=0.832(P＜0.05)。IHC檢測(cè)的敏感性為90.2％(37/41)，特異性為97％(97/100)。
　　3、生存分析:Kaplan-Meier單因素生存分析顯示MSI-H患者總生存(OS)率及無(wú)病生存(D

15、FS)率均顯著優(yōu)于MSS/MSI-L患者(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)本研究中有9.51％的SCRC發(fā)生MMRP的表達(dá)缺失，MMRP的表達(dá)缺失較常發(fā)生在右半結(jié)腸癌，低分化癌、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌以及腫塊較大的病例。
　　(2)MMRP的表達(dá)缺失和/或MSI-H患者預(yù)后較好，無(wú)病生存及總生存率均優(yōu)于MMRP陽(yáng)性和/或MSS/MSI-L患者，MMRP表達(dá)狀況是SCRC總生存率獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　(3)運(yùn)