結(jié)直腸癌患者血清外泌體DNA與RNA中基因突變的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer；CRC）是全球發(fā)病率第三位，致死率第四位的惡性腫瘤。它的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境、遺傳等多種因素密切相關(guān)，是多基因、多步驟的累積過程。近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率也逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。由于早期無明顯的病理癥狀，大部分結(jié)直腸癌患者初診時即為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（metastatic colorectal cancer;mCRC），即使部分患者接受了手術(shù)治療，仍會出現(xiàn)術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，因

2、此，化療在結(jié)直腸癌，尤其是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療中至關(guān)重要。FOLFOX和FOLFIRI作為目前化療的一線治療方案，能夠有效緩解患者病情，但患者的中位生存期仍不到2年。靶向EGFR單克隆抗體-西妥昔單抗（Cetumimab）和帕尼單抗（Panitumumab）的出現(xiàn)，成為治療結(jié)直腸癌的重大突破。
　　靶向EGFR單克隆抗體，通過與EGFR配體表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）等競爭性的結(jié)合EGFR的胞外區(qū)，阻止EG

3、FR的激活，阻斷EGFR下游信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。然而，并非所有患者都能從EGFR單抗靶向治療中受益，目前研究認(rèn)為，靶向EGFR單克隆抗體療效受到EGFR信號通路基因突變的影響，通過對KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等基因的突變檢查，可以篩查耐藥的患者。因此，靶向治療前與治療中的基因突變檢測十分重要。
　　基因突變檢測，目前主要依賴組織學(xué)檢查，標(biāo)本來源于手術(shù)、結(jié)腸鏡或穿刺活檢，然而這些侵入性的檢查

4、，并不是所有患者都可以接受。并且，對已經(jīng)進(jìn)行了原發(fā)腫瘤根治性切除的結(jié)直腸癌患者而言，受轉(zhuǎn)移灶的大小和位置等原因限制，獲取轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織在臨床常常是較為困難的，會對患者造成一定的傷害，存在著較大的風(fēng)險。此外，腫瘤異質(zhì)性的存在，易造成檢測結(jié)果的假陰性。因此，基于血液的非侵入性檢查代替組織學(xué)檢查將會是檢測腫瘤基因突變的理想選擇。
　　外泌體是一種30~150nm的雙層膜囊泡，廣泛分布存在于各種體液。作為一類重要的細(xì)胞間通訊分子，外泌體

5、含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類以及多種核酸，且內(nèi)含物與來源細(xì)胞具有一致性。在腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞與周圍支持細(xì)胞間信號交流的需求量增加，外泌體的分泌量明顯增加。因此，對腫瘤患者的血清外泌體內(nèi)含物進(jìn)行分析和檢測，可輔助腫瘤的早期診斷、療效評價和預(yù)后分析。本研究希望通過對結(jié)直腸癌患者血清外泌體中DNA、mRNA的檢測與腫瘤組織檢測結(jié)果對比，達(dá)到用外泌體DNA、mRNA檢測替代腫瘤組織基因突變檢測，以輔助早診、臨床用藥指導(dǎo)以及評估。
　　本研究中

6、，我們收集了90例臨床確診結(jié)直腸癌患者的全血標(biāo)本，分別提取血細(xì)胞DNA、外泌體DNA以及外泌體mRNA。將3種核酸標(biāo)本分別進(jìn)行KRAS G12/G13、KRAS Q61，BRAF V600，NRAS Q61以及PIK3CA E542/E545、H1047相應(yīng)片段的PCR擴(kuò)增。通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，檢測90例結(jié)直腸癌患者血細(xì)胞DNA、血清外泌體DNA與mRNA中的突變情況，并與臨床組織學(xué)檢查結(jié)果相比較。
　　本研究結(jié)果顯示

7、，通過高通量測序，90例結(jié)直腸癌患者外泌體DNA和mRNA中均檢出不同頻率的8種類型的基因突變，分別為：KRAS基因中G12D、G12V、G12A、G12S和G13D，PIK3CA基因中E542K、E545K、H1047R。
　　外泌體DNA中共檢出54例突變患者（突變率60.00％），其中KRAS基因突變51例（突變率為56.67%），PIK3CA基因突變42例（突變率為46.67%），KRAS基因合并PIK3CA基因突變的患者

8、39例（突變率為43.33%）。KRAS基因中，檢出G12D突變42例（突變率為46.67%），G12V突變1例（突變率為1.11%），G12A突變1例（突變率為1.11%），G12S突變1例（突變率為1.11%），G13D突變25例（突變率為27.78%）；PIK3CA基因中，檢出E542K突變20例（突變率為22.22%），E545K患者10例（突變率為11.11%），H1047R突變27例（突變率為30%）。
　　外泌體mR

9、NA中共檢出49例突變患者（突變率為54.44%），其中KRAS基因突變40例（突變率為44.44%），PIK3CA基因突變39例（突變率為43.33%），KRAS基因合并PIK3CA基因突變的患者30例（突變率為33.33%）。KRAS基因中，檢出G12D突變32例（突變率為35.56%），G12V突變1例（突變率為1.11%），G12A突變1例（突變率為1.11%），G12S突變1例（突變率為1.11%），G13D突變17例（突變率

10、為18.89%）。PIK3CA基因中，檢出E542K突變16例（突變率為17.78%），E545K突變檢出9例（突變率為10%），H1047R突變檢出24例（突變率為26.67%）。
　　本研究進(jìn)一步對90例結(jié)直腸癌患者外泌體DNA與血細(xì)胞DNA進(jìn)行相應(yīng)基因突變頻率的比較，結(jié)果顯示血細(xì)胞DNA突變頻率均小于1%，提示外泌體DNA中的突變來自于腫瘤細(xì)胞，可以反映腫瘤組織的突變。
　　為了進(jìn)一步探討外泌體中DNA與mRNA的突變

11、是否與組織相關(guān)，本研究將外泌體DNA與mRNA的KRAS基因突變檢測結(jié)果分別與組織DNA檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，外泌體DNA中，KRAS G12突變檢測靈敏度為90.63%，特異度為75.86%，與組織學(xué)檢測一致性為81.11%；KRAS G13突變檢測靈敏度為100%，特異度為82.28%，與組織學(xué)檢測一致性為84.44%。外泌體mRNA中，KRAS G12突變檢測靈敏度為68.75%，特異度為81.03%，與組織學(xué)檢測一致性為7

12、6.67%；KRAS G13突變檢測靈敏度為63.63%，特異度為87.34%，與組織學(xué)檢測一致性為84.44%。提示外泌體DNA與mRNA的突變檢測能夠反應(yīng)腫瘤組織DNA的突變情況，兩種檢測方法均顯示出了較好的臨床應(yīng)用的潛在價值，尤其是外泌體DNA的突變檢測，顯示出了更好的敏感性與一致性。
　　在外泌體DNA與mRNA的比較研究中，mRNA中突變的患者均存在DNA突變，且二者突變類型一致，但mRNA中突變檢出率為DNA的70.0

13、0%~85.00%。此外，各基因中DNA突變頻率高于mRNA患者的數(shù)量均超過85.00%。以上兩方面均說明外泌體mRNA中存在突變基因的低表達(dá)或不表達(dá)，通過對外泌體mRNA的突變檢測可以了解突變基因在轉(zhuǎn)錄組中的影響。本研究進(jìn)一步對KRAS G12、KRAS G13、PIK3CA E542、PIK3CA E545和PIK3CA H1047在外泌體DNA與mRNA的檢測突變率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，各基因突變檢測在外泌體mRNA與DNA比較均無

14、統(tǒng)計學(xué)意義。
　　本研究還收集了20例使用西妥昔單抗治療的結(jié)直腸癌患者的血清標(biāo)本，對西妥昔治療過程中外泌體DNA突變進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測研究。結(jié)果顯示，外泌體DNA的突變水平與西妥昔的療效具有密切相關(guān)性，突變頻率的增高能夠早期預(yù)示西妥昔耐藥，且預(yù)測能力優(yōu)于目前臨床腫瘤標(biāo)志物。外泌體DNA突變水平的檢測可以實現(xiàn)臨床腫瘤實時微創(chuàng)監(jiān)測，可能成為指導(dǎo)臨床靶向EGFR單抗治療的新方法。
　　綜上所述，外泌體中DNA與RNA的突變檢測可以反映腫