豚鼠磷酸二酯酶基因cDNA的鑒定與分析.pdf

1、耳蝸是一種非常復(fù)雜的感受器，是聽覺信號(hào)轉(zhuǎn)換及傳導(dǎo)的樞紐。其聽覺功能的運(yùn)行需要多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同協(xié)作完成，其中一氧化氮（NO）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是其中之一，該信號(hào)途徑參與耳蝸血流調(diào)節(jié)和神經(jīng)傳導(dǎo)，在內(nèi)耳多種疾病形成過程中起重要作用。NO分子是NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重要成員，它在人體各個(gè)系統(tǒng)中的功能具有雙重性：既保護(hù)組織也會(huì)傷害組織，濃度過高過低都可導(dǎo)致疾病發(fā)生。NO合成酶（NOS）和磷酸二酯酶（PDE）是決定NO濃度高低的兩個(gè)重要酶，前者負(fù)責(zé)NO的合

2、成，后者負(fù)責(zé)NO的降解。迄今已發(fā)現(xiàn)三種NOS：神經(jīng)細(xì)胞型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS），不同類型NOS的分布及功能均有較大的差別。PDE是一個(gè)超家族酶系，由12個(gè)族23亞族組成，每個(gè)成員分布不同，均有各自作用的特異性底物和抑制劑，部分抑制劑已開發(fā)成治療疾病的藥物。目前發(fā)現(xiàn)耳蝸中表達(dá)三種NOS酶：nNOS、iNOS和eNOS，但卻未見有PDE的表達(dá)。 豚鼠的聽覺范圍與人類接近，是一種理想的聽

3、覺實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物。然而豚鼠中Pde基因家族成員及其組織特異性表達(dá)情況至今還未見報(bào)道。本研究的目的是通過分析人及小鼠的Pde基因cDNA編碼序列的保守區(qū)，并采用RT-PCR方法檢測(cè)耳蝸及其他組織中表達(dá)的未知Pde基因cDNA編碼序列保守區(qū)，對(duì)陽性PCR片段進(jìn)行直接測(cè)序，用生物信息學(xué)軟件分析序列特征，以期發(fā)現(xiàn)豚鼠耳蝸及其他組織中表達(dá)的未知Pde基因，為克隆豚鼠Pde基因cDNA全長(zhǎng)及其在耳蝸等其他組織中的生理功能和相關(guān)疾病的研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4、 方法：從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載人及小鼠PDE基因家族成員cDNA編碼序列，在豚鼠基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得豚鼠Pde基因同源序列。將不同物種同源序列進(jìn)行比較分析，得到保守區(qū)；提取豚鼠不同組織的總RNA，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接雙向測(cè)序，將所得未知序列與人、小鼠及家兔的PDE基因cDNA編碼序列進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì)算同源率；采用蛋白翻譯軟件對(duì)部分cDNA序列進(jìn)

5、行翻譯，得到部分蛋白多肽序列，并進(jìn)行物種間的同源性分析，用t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所有人及小鼠Pde基因cDNA編碼區(qū)序列在豚鼠中的同源序列均散布在基因組20 kb至800 kb范圍內(nèi)，形成類似于人和小鼠PDE基因的編碼外顯子，序列的同源率均高達(dá)85％以上，人與豚鼠的PDE基因同源率大部分高于小鼠與豚鼠的同源率（PDE6D、PDE8B和PDE9A除外）；豚鼠部分同源外顯子在人和小鼠中是高度保守的（同源率高達(dá)

6、90％以上，片段長(zhǎng)度差異小于10 bp）。 RT-PCR結(jié)果顯示：豚鼠耳蝸中檢測(cè)6個(gè)與預(yù)期大小相符合的Pde基因cDNA陽性片段（Pde3α、Pde4d、Pde8α、Pde8b、Pde9α和Pdellα）；其他組織也獲得不同Pde基因cDNA陽性片段：其中胃15個(gè)，睪丸14個(gè)，骨骼肌12個(gè)，腦12個(gè)，心臟9個(gè)，小腸8個(gè)，腎6個(gè)，肺臟3個(gè)，肝臟2個(gè)，它們涵蓋了所有23個(gè)Pde基因，不同組織中Pde基因陽性片段也互不相同，與文獻(xiàn)報(bào)

7、道的Pde基因表達(dá)產(chǎn)物在人及小鼠不同組織中的分布情況大致相同。 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序獲得20個(gè)Pde基因部分cDNA序列。PDE基因cDNA及蛋白序列比較分析發(fā)現(xiàn)，豚鼠與人PDE基因cDNA序列的同源在83．8％～95．5％之間，蛋白序列的同源率在91．0％～100％之間；豚鼠與小鼠之間cDNA序列的同源在83．6％～93．0％之間，蛋白序列的同源率在86．6％～100％之間。豚鼠與人之間的大多數(shù)PDE基因cDNA和蛋白序列同源

8、率要高于豚鼠與小鼠之間的同源率。統(tǒng)計(jì)豚鼠與人及小鼠之間的20個(gè)PDE基因cDNA和蛋白序列同源率，發(fā)現(xiàn)豚鼠與人的PDE基因cDNA序列的同源率要顯著高于豚鼠與小鼠之間的同源率；雖然大多數(shù)豚鼠與人蛋白序列的同源率高于豚鼠與小鼠之間的同源率，但沒有顯著性差異。還發(fā)現(xiàn)大部分豚鼠與家兔的Pde基因cDNA序列同源率介于人和小鼠之間，提示與家兔和小鼠相比較，豚鼠與人可能有著更近的親緣關(guān)系。 結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)耳蝸中存在6個(gè)Pde基因mRNA產(chǎn)