竹葉青蛇毒磷酸二酯酶的研究.pdf

1、磷酸二酯酶(PDEs)是一個(gè)超級(jí)酶家族，在細(xì)胞外核苷酸代謝和調(diào)節(jié)以核苷酸為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)等功能中有多重作用。PDEs影響多個(gè)途徑的生理學(xué)過(guò)程，包括早期炎癥介質(zhì)的生成及發(fā)展，離子通道，肌肉收縮，脂肪生成，肝糖生成和糖質(zhì)分解等。PDEs廣泛存在于蛇毒中，一般都是大分子量（>90kDa），單個(gè)多肽鏈的蛋白。PDEs有廣泛的底物特異性，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，煙酰胺鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(NGD)，ATP，ADP等生物體內(nèi)重要的核苷酸，都能被

2、它水解。雖然有些 PDEs已經(jīng)從蛇毒中被分離出來(lái)，但是它們的氨基酸或者全長(zhǎng)cDNA序列到現(xiàn)在都沒(méi)有可參考的信息。到目前為止，竹葉青蛇毒中還沒(méi)有分離純化出PDE，鑒于PDEs多重的生理學(xué)功能，因此希望能從竹葉青蛇毒中分離出一種新型的PDE。本文主要講述了竹葉青蛇毒中PDE的分離純化,結(jié)構(gòu)和酶活性。
　　 第一章：概述了PDEs的研究進(jìn)展，以及常用的研究蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)手段。通過(guò)這一章可以對(duì)PDEs的生物學(xué)功能,分類(lèi)，組織分布及晶體結(jié)構(gòu)

3、有全面的了解。文中同時(shí)也介紹了蛇毒中的PDEs的結(jié)構(gòu)和酶活性。其次對(duì)研究蛋白質(zhì)的幾種常用手段做了總結(jié)，包括紫外光譜、熒光光譜、離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)測(cè)序。
　　 第二章：文中首次介紹了通過(guò)離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜從竹葉青蛇毒中提純出磷酸二酯酶（TS-PDE）的方法。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定了TS-PDE的分子量為100KD，并且是由二硫鍵連接的二聚體組成。通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦電泳，測(cè)定出TS-P

4、DE的等電點(diǎn)為5.1。另外，上述的兩種檢測(cè)方法也說(shuō)明了TS-PDE是一種單一的蛋白質(zhì)。通過(guò)Edman降解法對(duì)蛋白質(zhì)N端序列進(jìn)行了分析，TS-PDE的四個(gè)N端序列分別為：纈氨酸/絲氨酸，谷氨酰胺/亮氨酸，丙氨酸/酪氨酸,天冬氨酸/亮氨酸。由于兩條鏈的N端氨基酸序列不同，因此TS-PDE是由二硫鍵連接的異型二聚體，與其它已知PDEs結(jié)構(gòu)有所不同。另外,也測(cè)定了TS-PDE的糖含量。
　　 第三章：在本章中主要研究了TS-PDE的酶活

5、性及其對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用。實(shí)驗(yàn)中主要利用HPLC的方法，以NAD,NGD,ATP，ADP為底物，詳細(xì)的闡述了TS-PDE的酶活性并測(cè)定了各個(gè)底物的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。PDEs有廣泛的底物特異性，NAD,NGD，ATP，ADP均可被TS-PDE催化水解。在蛇毒中分離純化PDE的過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是純化的PDE中含有5'-核苷酸酶和堿性磷酸酶的雜質(zhì)。為了驗(yàn)證TS-PDE的純度，分別以AMP和對(duì)-苯硝基磷酸鹽為底物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果

6、在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均未發(fā)現(xiàn)有5'-核苷酸酶和堿性磷酸酶活性，這進(jìn)一步證明了竹葉青蛇毒中純化分離的TS-PDE是一種單一的酶。TS-PDE是從DNA的3'端開(kāi)始逐一水解磷酸二酯鍵，釋放5'-磷酸單核苷酸的，所以它可作為一種工具應(yīng)用于寡聚和多聚核苷酸氨基酸序列的測(cè)定。我們同時(shí)測(cè)定了TS-PDE對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，實(shí)驗(yàn)證明TS-PDE能夠明顯的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，因此，它可能成為一種潛在的抗血栓藥物。
　　 第四章：本章

7、主要研究了金屬離子和鏈間二硫鍵對(duì)TS-PDE酶活性和結(jié)構(gòu)的影響。利用離子體發(fā)射光譜儀和質(zhì)譜儀，測(cè)定TS-PDE結(jié)構(gòu)中有Cu2+和 Zn2+的存在。據(jù)所知，TS-PDE是唯一一個(gè)含有Cu2+的磷酸二酯酶。金屬螯合物EDTA基本上能夠完全抑制TS-PDE的酶活性，說(shuō)明金屬離子的存在對(duì)TS-PDE的酶活性是必需的。在去金屬離子的TS-PDE（apo-TS-PDE）中加入Cu2+和 Zn2+，對(duì)酶活性都有一定的恢復(fù)作用,說(shuō)明TS-PDE的活性依